Åben kromatin ( engelsk open chromatin ) - små områder af kromatin , fri for nukleosomer [1] . Plantning af nukleosomer forhindres generelt af kromatin-associerede proteinfaktorer , der genkender visse DNA-sekvenser . Disse proteiner omfatter transkriptionsfaktorer , DNA- eller RNA- polymeraser . Åben kromatin falder ofte sammen med cis-regulatoriske sekvenser , nemlig: promotorer , forstærkere , isolatorer , lyddæmpere , oprindelsessteder for DNA-replikation [2] . Størrelsen af åbne sektioner af kromatin er normalt flere hundrede basepar , i gennemsnit omkring 300 bp [3] .
Åben kromatin bestemmes oftest ved hjælp af DNase-følsomhedsmetoden. Nukleosomfrie områder af kromatin angribes fortrinsvis af DNase I , når permeabiliserede celler eller isolerede kerner behandles med det . I denne henseende omtales åbent kromatin ofte som DNase I hypersensitive sites eller hypersensitive sites . Sandsynligheden for DNA-spaltning med nuklease på overfølsomme steder kan overstige gennemsnittet med hundreder og endda tusindvis af gange. Overfølsomhed over for åben kromatin DNase I bør skelnes fra øget generel DNase-følsomhed af aktivt transskriberede gener [4] .
Afhængigt af typen af proteinfaktorer, hvis binding til DNA forhindrer nukleosom-landing, kan DNase I-hypersensitive kromatinregioner være vævsspecifikke eller konstitutive, det vil sige til stede i celler differentieret langs forskellige veje.
For at kortlægge områder med åben kromatin anvendes DNase -følsomhed ( DNase I-hypersensitiv ) og isolering af regulatoriske elementer ved hjælp af formaldehyd . formaldehyd-assisteret isolering af regulatoriske elementer (FAIRE) [1] . DNase-følsomhedsmetoden tillader ikke, at man kan bestemme, hvilket regulatorisk sted dette område af åben kromatin er [1] .
Tidligere blev analysen af resultaterne af DNase-følsomhedsmetoden udført under anvendelse af Southern blot- hybridisering ( eng. Southern blot ). Dette gjorde det ikke muligt for os at analysere et stort antal steder, samt at finde nye steder med overfølsomhed. DNase-følsomhedsanalyse kan også udføres ved brug af real-time PCR (kvantitativ PCR). Dette er meget enklere end Southern blot-hybridisering, men denne metode har også et begrænset antal steder til analyse og kan ikke bruges til en genomomfattende undersøgelse af fordelingen af DNase I-følsomhedssteder [5] .
Udviklingen af high - throughput sekventering og DNA -microarray metoder gør det muligt at kortlægge åbne kromatinregioner i hele genomet [ 6 ] . Derudover giver kombinationen af DNase-følsomhedsmetoden med Chromatin immunoprecipitation ( ChIP) metoden efterfulgt af high-throughput sekventering mere information om bindingen af specifikke transkriptionsfaktorer til aktive kromatinsteder [1] .
En anden måde at kortlægge områder med åben kromatin på er at udføre kromatin-immunpræcipitation ( ChIP ) for antistoffer mod histoner . Samtidig bør åbne kromatinregioner være dårligt repræsenteret, da nukleosomer ikke er forbundet med dem. Metoden til DNase-følsomhed og histonimmunpræcipitation giver lignende resultater [7] .
I eukaryote genomer er ikke-kodende sekvenser involveret i reguleringen af genekspression på forskellige stadier af udvikling af en organisme eller i forskellige væv af særlig betydning. Opdagelsen og karakteriseringen af regulatoriske regioner bliver afgørende for at forstå mønstre i genekspression [5] . Så i det menneskelige genom er mere end 95% af DNA ikke-kodende . Denne klasse af sekvenser, udover junk-DNA , inkluderer vigtige regulatoriske sekvenser: promotorer, enhancere, lyddæmpere, isolatorer eller kontrol loci ( locus control regions (LCR) ) . ENCODE-konsortiet har vist, at DNase I-overfølsomhedssteder identificeret i 1% af det humane genom er markører for histonmodifikationer , tidlige replikationssteder , transkriptionsstartsteder og transkriptionsfaktorbindingssteder [8] . Også åben kromatin er ofte forbundet med aktivt transskriberede ikke-kodende RNA'er [8] .
Ud over ikke-kodende regulatoriske sekvenser er åben kromatin også forbundet med exoner og introner af aktivt transskriberede gener. Især ofte falder sådanne områder af åben kromatin sammen med genets første exon og intron [5] . Tilstedeværelsen af åben kromatin er imidlertid ikke en tilstrækkelig betingelse for genaktivitet. Ikke-transskriberede gener forbundet med åben kromatin er i en tilstand af "beredskab" til transskription ( engelsk poised state ) [5] . Således er dannelsen af åben kromatin eller overgangen til en inaktiv tilstand vigtig for reguleringen af genekspression.
Ikke kun bindingsstederne for transkriptionsfaktorer og andre regulatoriske proteiner kan være fri for nukleosomer. Nogle DNA-sekvenser er ude af stand til at vikle sig rundt om nukleosomale kugler. Det er sekvenser, der har reduceret fleksibilitet, og sekvenser, der har tendens til at skabe ikke-kanoniske strukturer, såsom hårnåle [9] .
UCSC Browser - skærmbilledet viser kolokalisering af et DNaseI Hypersensitivity Clusters-sted med promotorer af to gener. Områder med åben kromatin er omgivet af H3 [ histoner acetyleret ved den 27. lysinrest ( H3K27Ac), som er en mærkning for aktive kromatin regulatoriske regioner såsom promotorer og enhancere. Derudover er der i regionen af DNase-overfølsomhedsstedet et bindingssted for mange transkriptionsfaktorer, blandt hvilke man kan finde den bevarede transkriptionsinitieringsfaktor TBP (den er hoveddelen af TFIID ). Du kan også bemærke den hyppige binding i denne region af RNA-polymerase II , som udfører transskriptionen af proteinkodende gener hos mennesker . Dette sted for DNase-overfølsomhed er karakteriseret ved øget konservatisme blandt pattedyr ( Eng. Mammal Cons ), hvilket betyder, at denne sekvens bevares under evolutionen , og som følge heraf dens funktionelle betydning [8] .
Dannelsen af områder fri for nukleosomer sker under påvirkning af særlige faktorer, der udfører samling, adskillelse og bevægelse af nukleosomer. Processen med at ændre nukleosomernes position kaldes kromatin-remodellering . Det involverer kromatin-ombygningskomplekser - konservative proteinkomplekser, der arbejder med energiforbruget af ATP . Chromatin remodeling udføres efter introduktionen af visse epigenetiske mærker - histonmodifikation eller DNA-methylering . Hvis mærkerne svarer til aktiv kromatin (f.eks. acetyleret 9. lysin af histon H3, di- og trimethyleret 4. lysin af histon H3 og mange andre), så dannes områder med åben kromatin. Ofte har profilen af histonmodifikationer en bestemt fordeling omkring DNase I-overfølsomhedsstedet [5] .
Meget effektive metoder gør det muligt at sammenligne fordelingen af åbne kromatinregioner i forskellige væv eller cellekulturer fra den samme organisme. En sådan sammenligning afslører en signifikant forskel i fordelingen af sådanne regioner i genomet [5] . Dette indikerer en forskellig aktivitet af sådanne steder i forskellige væv. Promotoren og forstærkeren af et gen kan således være lokaliseret i den åbne kromatinregion i ét væv og lukkes af nukleosomer i et andet. Dette indikerer forskellig genekspression i forskellige væv og er mest karakteristisk for vævsspecifikke gener . Omvendt omtales gener fundet i den åbne kromatinregion i alle væv og cellelinjer normalt som husholdningsgener . Profilen af DNase-følsomhed kan også ændre sig under celleudvikling og differentiering. For at identificere aktiviteten af vævsspecifikke gener skal du bruge definitionen af genontologi ( eng. Gene Ontology (GO) ) efter at have udført DNase-seq [5] .