MTT-test er en kolorimetrisk test til vurdering af cellers metaboliske aktivitet. NADP-H-afhængige cellulære oxidoreduktase-enzymer kan under visse betingelser afspejle antallet af levedygtige celler. Disse enzymer er i stand til at reducere tetrazoliumfarvestoffet 3-(4,5 - dimethylthiazol -2-yl) -2,5 - diphenyl - tetrazoliumbromid til uopløseligt formazan , som har en lilla farve. Andre nært beslægtede tetrazoliumfarvestoffer er XTT, MTS og WST, som bruges i forbindelse med det elektrontiltrækkende mellemprodukt, 1-methoxy-phenazin-methosulfat (PMS). Med WST-1, som ikke kommer ind i celler, sker reparation uden for cellen via elektrontransport over cellevæggen. [1] Tetrazolium-farvestoffer kan også bruges til at måle cytotoksiciteten (tab af levende celler) eller cytostatisk aktivitet (skift fra spredning til hviletilstand) af potentielle lægemidler og giftige stoffer. MTT-test udføres normalt i mørke, da MTT-reagenser er følsomme over for lys.
MTT , gul tetrazol , reduceres til lilla formazan i levende celler. [2] En opløsningsmiddelkomponent (normalt enten dimethylsulfoxid , en sur ethanolopløsning eller en opløsning af detergenten natriumlaurylsulfat (SLS) eller natriumdodecylsulfat (SDS) i fortyndet saltsyre ) tilsættes for at omdanne den uopløselige lilla formazan til en farveopløsning. Absorbansen af denne farvede opløsning kan kvantificeres ved at måle ved en specifik bølgelængde (normalt mellem 500 og 600 nm) ved spektrofotometri . Graden af lysabsorption afhænger af opløsningsmidlet.
XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilid) er blevet foreslået som en erstatning for MTT, hvilket giver større følsomhed og højere dynamisk område. Det resulterende formazanfarvestof er opløseligt i vand og undgår således det sidste trin af opløsning. [3]
Vandopløselige tetrazoliumsalte er nyere alternativer til MTT: de blev udviklet ved at indføre en positiv eller negativ ladning og hydroxylgrupper i benzenringen af tetrazoliumsaltet, eller endnu bedre sulfonatgrupper , som tilføjer benzenringen direkte eller indirekte.
MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium), i nærvær af phenazinmethosulfat ( PMS ) producerer et formazanprodukt med absorptionsmaksimum ved 490-500 nm i fosfatbufret saltvand. MTS-testen beskrives ofte som en 'one-step' MTT-test, hvor det er praktisk at tilføje reagenset direkte til cellekulturen uden de periodiske trin i MTT-testen. Denne bekvemmelighed gør imidlertid MTS-assayet modtageligt for interferens i kolorimetriske assays, da batch-trinene i MTT-assayet tillader spor af farvestoffer at blive fjernet, mens de forbliver på mikrotiterpladen i et-trins MTS-assayet. Man skal sørge for, at denne metode bruges nøjagtigt. Disse er stærke nok argumenter til at validere MTS-resultater ved hjælp af kvalitativ observation under et mikroskop. (Denne bemærkning er dog relevant for alle kolorimetriske tests.) [4]
WST'er ( engelsk Water-soluble Tetrazolium salts , Water-soluble tetrazolium salts) er en gruppe af andre vandopløselige farvestoffer til MTT-testen, designet til at give forskellige absorptionsspektre af de resulterende formazaner. [5] WST-1 og især WST-8 (2-(2-methoxy-4-nitropentyl)-3-(4-nitropentyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium) har fordele i forhold til MTT ved, at de genoprettes uden for cellerne, kombineres med PMS elektronmediatoren og danner en vandopløselig formazan. Endelig kan WST-test (1) læses med det samme (i modsætning til MTT-test, der kræver et opløsningstrin), (2) give et mere effektivt signal end MTT og (3) reducere celletoksicitet (i modsætning til cellegennemtrængeligt MTT og dets uopløselige formazan, som ophobes inde i cellerne). [5]
Restaurering af tetrazoliumfarvestoffet afhænger af NADP-H-afhængige oxidoreduktase-enzymer, for det meste i cellens cytosol. [6] [7] Derfor afhænger reduktionen af MTT og andre tetrazoliumfarvestoffer af cellulær metabolisk aktivitet på grund af strømmen af NADP-H. Celler med lavt stofskifte, såsom thymocytter (thymusceller) og miltmakrofager, genvinder meget lidt MTT. I modsætning hertil viser hurtigt delende celler en høj grad af MTT-genvinding. Det er vigtigt at huske, at testbetingelser kan ændre metabolisk aktivitet og dermed reduktion af tetrazoliumfarvestoffer uden at påvirke cellernes levedygtighed. Derudover bestemmer reduktionsmekanismen for tetrazoliumfarvestoffer, dvs. intracellulær (MTT, MTS) versus ekstracellulær (WST-1), også mængden af produkt.
Når testcellerne koloniserer porøse materialer, kan resultaterne af MTT-testen blive påvirket af tykkelsen af sådanne materialer. [otte]