Immunofluorescensanalyse ( MFA - method of fluorescent antibodies , immunofluorescence ) ( eng. Immunofluorescence ) - et sæt immunologiske metoder til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af overflade- og intracellulære antigener i prøver af cellesuspensioner (cellekulturer, bakterier, mycoplasmas, virus rickettsiaemer) ), blodprøver, knoglehjerne, alveolære skylninger, tynde vævssnit. Metoden gør det muligt at analysere biologiske prøver i detaljer for tilstedeværelsen af visse antigene determinanter, der er karakteristiske for visse patogener eller sygdomme, for at kvantificere både overflade- og intracellulære proteiner og receptorer. Undersøgelse og evaluering kan udføres manuelt ved hjælp af et fluorescerende mikroskop eller automatiseret ved hjælp af et flowcytometer ( flowcytometer ) eller mikrochipcytometer ( chipcytometer ). Det er muligt at bruge et konfokalt mikroskop og et robot-fluorescerende mikroskop (inklusive dem kombineret med et flowcytometer) i kombination med et software billedbehandlingssystem. De aktuelt tilgængelige automatiserede teknologier gør det muligt at analysere omkring 50 forskellige antigener i en prøve ved hjælp af et sæt af forskellige fluorescerende markører i formatet af meget informativ mikroskopi og cytometri (metoder kaldes high-content imaging , high-content cytometry , high-content screening ) og omkring halvt så meget det maksimale sæt af antigener ved hjælp af moderne flowcytometri eller konfokal mikroskopi. De vigtigste praktiske anvendelser er onkologi, mikrobiologi, cellebiologi, genetik, farmakologi osv.
Essensen af metoden ligger i visualiseringen af antigenet med specifikke antistoffer med fluorescerende markører. Metoden til konjugation af globuliner med organiske fluorochromer blev udviklet i 1942 af A. Koons. [1] I øjeblikket bruger metoden både antistoffer mod forskellige antigener og specifikke farvninger for DNA (f.eks. DAPI ), RNA (f.eks. Sybr Green II ), lipider og proteiner.
I den grundlæggende MFA-teknik skelnes der mellem den direkte metode udviklet af A. Koons og Melvin Kaplan [2] og den indirekte metode udviklet af A. Koons og Wheeler i den originale version af indirekte MFA med komplement .
I den direkte metode ( pMPA ) påføres en opløsning af antistoffer, der er direkte mærket med et fluorescerende farvestof, på testpræparatet eller cellesuspensionen. Dannelsen af et antigen-antistofkompleks detekteres af et fluorescerende signal i form af en glød af varierende grader af intensitet og klarhed.
Med den indirekte metode ( nMFA ) påføres præparatet antistoffer mod de ønskede antigener (de såkaldte "første" antistoffer), og derefter artsspecifikke "andet" antistoffer mod de "første" antistoffer, hvilket undgår uspecifikke reaktioner. I dette tilfælde er kun det andet antistof konjugeret med et fluorescerende farvestof. For eksempel, hvis der i undersøgelsen bruges museantistoffer, muse-IgG, som de "første" antistoffer, så bruges anti-arts-anti-muse-IgG konjugeret med et fluorescerende farvestof som de "andre". Antigen-antistofkomplekset producerer kun fluorescerende farvning efter binding til et "andet" antistof.
Indirekte metoder kræver kun sera af antiglobulinarter med fluorokromer, men kræver et stort antal testkontroller. Ved indstilling med den direkte metode foretages der kun én kontrol, selvom der i tidligere versioner af metoden var påkrævet mange monospecifikke sera. I lang tid var ulemperne ved direkte typer af MFA begrænset følsomhed på grund af tilstedeværelsen af mulige krydsreaktioner mellem objekter med lignende antigensammensætning og uspecifik fluorescens på grund af adsorptionen af fluorescerende globuliner på forskellige elementer af præparatet. For tiden anvendte kommercielle standardkonjugater indeholdende immunoglobuliner til de undersøgte antigener. Anvendelsen af biomanipulerede immunoglobuliner og en høj grad af antistofoprensning gjorde det muligt praktisk talt at ophæve uspecifikke reaktioner, hvilket muliggjorde yderligere teknologisk udvikling af metoden.
Da den direkte metode i øjeblikket undgår uspecifikke reaktioner, bruger automatiserede metoder overvejende den direkte metode til immunfluorescens.
Resultaterne af en manuel mikroskopisk vurdering er beskrevet i de såkaldte "kryds" (fra en + til fire ++++) - en subjektiv graduering af sværhedsgraden af reaktionen af forskerens øje. I automatiserede metoder bruges fotomultiplikatorer eller meget følsomme fluorescerende kameraer som en detektor, som gør det muligt at optage signalet med høj nøjagtighed og giver værdien af det relative fluorescensniveau (relativt fluorescensforhold) i et bredt område af skalaen. Den absolutte værdi beregnes ved hjælp af kontroller eller antigener med et kendt konstant indhold i prøven. Ved anvendelse af automatiserede metoder udføres databehandling af specialiserede programmer til billedbehandling og analyse af cytometriske data.
Metoden er af afgørende betydning ved tidlig diagnosticering og behandling af onkologiske sygdomme (immunhistokemi, onkohæmatologi), diagnosticering af infektionssygdomme (f.eks. bestemmelse af CD4+-celler i HIV) og arvelige syndromer. Automatiserede metoder er intensivt under udvikling, herunder områderne højindholdsbilleddannelse og højt indholdscytometri , kombinerede metoder til cytometri-mikroskopi ( cytometer-mikroskop ), som har udviklet sig sideløbende siden 90'erne , samt metoder til mikrochipcytometri med plasmonholografi [3 ] hvor individuelle antistoffer er mærket med nanopartikler.
| Patologi i medicin | |
|---|---|
| patohistologi | Celleskade apoptose Nekrobiose karyopynose karyorrhexis karyolyse Nekrose koagulativ nekrose kollikationsnekrose koldbrand sekvestrering hjerteanfald Cellulær tilpasning Atrofi Hypertrofi Hyperplasi Dysplasi Metaplasi pladeepitel kirtel Dystrofi Protein fed kulhydrat Mineral |
| Typiske patologiske processer |
|
| Laboratoriediagnostik og obduktion _ |
|