Ziehl-Nielsen-farvningsmetoden (ifølge Ziehl-Nelsen [1] ) er en farvningsmetode til mikroorganismer til at påvise syreresistente mykobakterier (forårsager til tuberkulose , mykobakteriose , spedalskhed ), actinomyceter og andre syreresistente mikroorganismer . Syreresistens hos mikroorganismer skyldes tilstedeværelsen af lipider , voks og hydroxysyrer i deres celler . Sådanne mikroorganismer farves dårligt med fortyndede farvestofopløsninger. For at lette indtrængning af farvestoffet ind i mikroorganismernes celler påføres Ziehls carboliske fuchsin på præparatet opvarmet over flammen fra en brænder. Farvede mikroorganismer misfarves ikke af svage opløsninger af mineralsyrer og alkohol.
Metoden er opkaldt efter tyske læger - mikrobiolog Franz Ziel og patolog Friedrich Nelsen ( Nielsen), som udviklede den i 1882-1883 .
opløs 0,3 g methylenblåt chlorid i 100 ml destilleret vand.
Når de farves med denne metode, bliver syreresistente bakterier intenst røde , resten af mikrofloraen farves lyseblå [3] .
Syreresistent Mycobacterium tuberculosis er cirka 1-10 mikron lang og 0,2-0,6 mikron bred. Normalt ses de i form af tynde yndefulde pinde, men nogle gange kan du finde buede eller snoede muligheder. Når det farves med carbolisk fuchsin , påvises mycobacterium tuberculosis som tynde, let buede hindbærrøde stænger, der indeholder et variabelt antal granulat. Mikroorganismer, placeret enkeltvis, i par eller i grupper, skiller sig godt ud mod den blå baggrund af andre komponenter af lægemidlet. Det er ikke ualmindeligt, at bakterieceller danner et romertal "V".
Inden for individuelle mikrobielle celler kan der findes områder med mere intens farvning, hvilket resulterer i et "perleagtigt" udseende, mens svagere farvningsområder kan ses som "striber". I præparatet kan ændrede cocci-lignende syreresistente former af patogenet, afrundede sfæriske eller mycelium-lignende strukturer også påvises. I tilfælde af påvisning af ændrede former for syreresistente mikroorganismer skal en positiv respons dog bekræftes af yderligere forskningsmetoder.
Nogle andre mikroorganismer, der ikke er relateret til M.tuberculosis , kan have forskellige former - fra lange pinde til coccoidformer med varierende farvningsintensitet. Varierende grader af syrefast farvning kan observeres ikke kun i mykobakterier, men også i andre mikroorganismer. Disse kan være Rhodococcus , Nocardia, Legionella , såvel som cyster af Cryptosporidium og Isospora . Hurtigtvoksende mykobakterier kan variere i graden af syrefast farve - med et delvist tab af syrefast farve får de en lilla-karminrød farve.
I en kulturundersøgelse gives svaret om isolering af syrefaste mykobakterier først efter mikroskopi af en Ziehl-Neelsen-farvet udstrygning fra dyrkede kolonier. Ved forberedelse af udstrygninger til mikroskopisk undersøgelse viser kolonier af Mycobacterium tuberculosis deres fysiske og kemiske egenskaber: de emulgerer ikke i en isotonisk opløsning, men danner en granulær, smuldrende suspension. Dette skyldes tilstedeværelsen i sammensætningen af deres cellevæg af et stort antal hydrofobe fedt-voksstoffer. Mikroskopisk undersøgelse af udstrygninger fra udvoksede kolonier, farvet ifølge Ziehl-Nelsen, afslører lyse karmoisinrøde stavformede bakterier, der ligger enkeltvis eller i grupper og danner klynger eller vævninger i form af "filt" eller "fletninger". Tuberkulosemykobakterier ligner tynde, lige eller let buede pinde 1-10 (normalt 1-4) µm lange, 0,2-0,6 µm brede, homogene eller granulære med let afrundede ender. Oftere i præparatet, især i langvoksende kulturer, er ophobninger af mørkfarvede korn synlige. I unge kulturer, især isoleret fra patienter behandlet i lang tid med anti-tuberkulose-lægemidler, er mykobakterier kendetegnet ved høj polymorfi, op til forekomsten af korte, næsten kokkoide former.
Mikroskopisk undersøgelse af en smear bør undersøge mindst 100 synsfelter for at kvantificere lægemidlet og påvise enkelte mykobakterier. I tilfælde af, at resultatet af en sådan undersøgelse viser sig at være negativt, ses yderligere 200 synsfelter til bekræftelse. Ved et betydeligt antal syreresistente mykobakterier er det nok at undersøge 20-50 synsfelter både med Ziehl-Neelsen-farvning og med fluorescerende mikroskopi (se tabel ). Under mikroskopisk undersøgelse af præparatet er det nødvendigt at være sikker på, at intet synsfelt af præparatet ses gentagne gange, derfor anbefales det altid at se præparatet efter samme skema:
De begynder at se præparatet fra det øverste venstre synsfelt valgt i udstrygningen, idet de gradvist bevæger sig enten langs præparatets længdeakse til slutningen af udstrygningen, eller bevæger sig ned og så op igen osv., passerer gennem alle synsfelter til kanten af udstrygningen. Med en mikroskopforstørrelse på 1000x, det vil sige 100x for et olienedsænkningsobjektiv og 10x for et okular, når man undersøger en slaglængde (~ 20 mm), ses omkring 100-120 synsfelter i en langsgående passage (feltdiameter - 0,16 - 0, 2 mm).
| Forskningsresultat | Minimum antal synsfelter (p/s) | Formular til resultatopgørelse | Fortolkning af undersøgelsesresultater |
|---|---|---|---|
| AFB [4] ikke detekteret i 300 p/s | 300 | OTR. | Negativ |
| 1 - 2 KUM på 300 p/s | 300 | Det anbefales at gentage undersøgelsen | Resultatet vurderes ikke |
| 1 - 9 KUM på 100 p/s | 100 | "_N__" KUM på 100 p/s [5] | Positiv |
| 10 - 99 KUM på 100 p/s | 100 | 1+ [6] | Positiv |
| 1 - 10 KUM på 1 p/s | halvtreds | 2+ [6] | Positiv |
| Mere end 10 KUM på 1 p/s | tyve | 3+ [6] | Positiv |