Gram metode

Den aktuelle version af siden er endnu ikke blevet gennemgået af erfarne bidragydere og kan afvige væsentligt fra den version , der blev gennemgået den 16. juli 2019; checks kræver 5 redigeringer .

Gram -  metoden er en metode til farvning af mikroorganismer til forskning, som gør det muligt at differentiere bakterier efter de biokemiske egenskaber af deres cellevæg . Foreslået i 1884 af den danske læge Hans Christian Gram .

Ifølge Gram farves bakterier med anilinfarvestoffer  - ensian eller methylviolet osv., derefter fikseres farvestoffet med en opløsning af jod . Ved efterfølgende vask af det farvede præparat med alkohol kaldes de bakterietyper, der viser sig at være fast farvede blå og har en tyk cellevæg, gram -positive bakterier, betegnet Gram (+) , - i modsætning til gram-negative (tynde ). cellevæg), Gram (-) , som blev misfarvet ved vask.

Efter skylning med opløsningsmiddel tilføjer Gram-farven et kontrastfarvet rødt farvestof, der farver alle Gram-negative bakterier røde eller lyserøde. Dette skyldes tilstedeværelsen af ​​en ydre membran, der forhindrer farvestoffets indtrængning i cellen. Testen klassificerer bakterier i to grupper baseret på strukturen af ​​deres cellevæg.

Brug i diagnostik

Gramfarvning er af stor betydning i bakteriers taksonomi, såvel som for den mikrobiologiske diagnosticering af infektionssygdomme.

Gram-positive kokkelformer (bortset fra repræsentanter for slægten Neisseria ) og sporebærende (med undtagelse af Coxiella burnetii ) former for bakterier, de farver blå-sort ( mørkeblå ) farve .

Mange ikke-spore-bærende bakterier er gram-negative og farves røde eller lyserøde.

Farvningsteknik

Gramfarvning refererer til en kompleks metode til farvning, når en udstrygning udsættes for to farvestoffer, hvoraf det ene er det vigtigste og det andet er et ekstra. Ud over farvestoffer bruges blegemidler til komplekse farvemetoder: alkohol, syrer osv.

Til Gram-farvning bruges anilinfarvestoffer af triphenylmethangruppen oftere: ensian, methylviolet eller krystalviolet . Gram-positive mikroorganismer giver en stærk forbindelse med de angivne farvestoffer og jod. Samtidig misfarves de ikke, når de udsættes for alkohol, som et resultat af, at gram-positive mikroorganismer med yderligere farvning med fuchsin ikke ændrer den oprindeligt vedtagne lilla farve.

Gram-negative mikroorganismer danner en forbindelse, der let ødelægges af alkohol med basiske farvestoffer og jod . Som et resultat bliver mikroberne misfarvede og farves derefter med magenta og bliver røde.

Forberedelse af materiale til maling

  1. Testmaterialet spredes i et tyndt lag over overfladen af ​​et godt affedtet objektglas.
  2. Den forberedte udstrygning tørres i luft og fikseres efter fuldstændig tørring.
  3. Histologiske snit fremstilles efter standardmetoden, hvor vævsstykker fikseres i formalin og hældes i paraffin.

Retter

Ved fiksering fikseres udstrygningen på overfladen af ​​glasglasset, og derfor vaskes mikrobielle celler ikke af under den efterfølgende farvning af præparatet. Derudover farves dræbte mikrobielle celler bedre end levende.

Der skelnes mellem den fysiske fikseringsmetode, som er baseret på virkningen af ​​høj temperatur på den mikrobielle celle, og kemiske metoder, som involverer brug af kemikalier, der forårsager koagulering af cytoplasmatiske proteiner.

Fysisk måde at rette på

Glasglasset med præparatet tages med pincet eller højre hånds I og II fingre af ribbenene med et slag opad og med en jævn bevægelse 2-3 gange over den øverste del af brænderflammen. Hele fikseringsprocessen bør ikke tage mere end 2 s.

Pålideligheden af ​​fikseringen kontrolleres ved følgende metode: overfladen af ​​glasset, der er fri for udstrygningen, påføres bagsiden af ​​venstre hånd. Ved korrekt fiksering af udstrygningen skal glasset være varmt, men ikke forårsage en brændende fornemmelse (70-80 ° C).

Kemisk fikseringsmetode

For at fikse udstrygningerne , methylalkohol , acetone , Nikiforovs blanding (en blanding af ethylalkohol 96% og bedøvende ester i forholdet 1: 1), Carnoys væske (96% ethylalkohol - 60%, chloroform  - 30%, iseddike syre  - 10%), alkohol-formol (40% formalin  - 5 ml, 96% ethylalkohol - 95 ml). Et objektglas med en tørret smøre nedsænkes i en flaske med et fikseringsmiddel i 10-15 minutter og tørres derefter i luft. Der anvendes også fiksering i par af 40% formalin i et par sekunder.

Processen med farvning af udtværinger

  1. Et af hovedfarvestofferne hældes på en fast udstrygning i 2-3 minutter. For at undgå nedbør, farves gennem filterpapir.
  2. Dræn malingen, fjern forsigtigt filterpapiret. Udstrygningen fyldes med Lugols opløsning eller Grams iodidopløsning (en vandig opløsning af kaliumiodid og krystallinsk jod i forholdet 2:1) i 1-2 minutter, indtil præparatet bliver sort.
  3. Opløsningen drænes, udstrygningen skylles med 96 ° ethylalkohol eller acetone , hældning og afdrypning, indtil udstrygningen er misfarvet, og den flydende væske er klar (ca. 20-40-60 sekunder).
  4. Objektglassene vaskes grundigt i rindende eller destilleret vand i 1-2 minutter.
  5. For at identificere den gramnegative gruppe af bakterier farves præparater yderligere med fuchsin eller safranin (2-5 min).
  6. Skyl i rindende vand og tør med filterpapir.

Gram -Weigert farvningsteknik for bakterier i histologiske snit

  1. Afparaffiniserede sektioner bringes til vand.
  2. Farv i 20 minutter i en 1% opløsning af pararosanilin eller basisk fuchsin i 1% eddikesyre (farveopløsningen opvarmes til kogning, afkøles og filtreres).
  3. Vasket i 3 skift destilleret vand.
  4. Farv i 5 minutter i 1% krystalviolet i destilleret vand.
  5. Skyl hurtigt i 1% natriumchloridopløsning.
  6. Behandlet i 30 s i en blanding: 1 del jod + 2 dele kaliumiodid + 100 dele destilleret vand.
  7. Våd med filterpapir.
  8. Differentier ved at påføre en blanding af lige store volumener anilin og xylen (1-2 ml) på udskæringen; opløsningerne drænes, indtil farveskyerne holder op med at bevæge sig væk fra snittet.
  9. Udfør 3 skift af xylen.
  10. Indesluttet i balsam eller enhver harpiks opløst i xylen.

Resultat: Gram-positive bakterier er blå-sorte, fibrin er lilla, kerner er røde.

Se også

Litteratur

På tysk
  • Gram, HCÜber die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten  (tysk)  // Fortschritte der Medizin: magazin. - 1884. - Bd. 2 . - S. 185-189 .
På engelsk
  • Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter HA Sneath. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology  (engelsk) . — 9. udgave — Lippincott Williams & Wilkins, 1994.
  • Madigan, M.T.; Martinko J; Parker J. Brock Biologi af mikroorganismer  (ubestemt) . — 10. udgave. Lippincott Williams & Wilkins, 2004.
  • Ryan, KJ; Ray, C.G. Sherris medicinsk mikrobiologi  (ubestemt) . - 4. udgave - McGraw Hill., 2004.
  • Anvendelse af pletter i klinisk mikrobiologi // Biotechnic & Histochemistry, bind 76, nummer 3, 01. maj 2001, pp. 119-125(7)
  Gå til Wikidata-elementet  Ordbøger og encyklopædier