To-hybridanalyse er en molekylærbiologisk metode, der tillader højpræcisionsdetektion af protein-protein- og DNA-protein-interaktioner under in vivo-betingelser .
Det er baseret på brugen af transkriptionsfaktorer bestående af fysisk og funktionelt adskillelige domæner : DNA-binding ( bindingsdomæne, BD ) og aktivatordomæne ( aktiveringsdomæne, AD ). Den fysiske interaktion mellem to rekombinante proteiner initierer fusionen af transkriptionsdomænerne "tværbundet" med dem, hvilket aktiverer ekspressionen af reportergener .
For første gang blev metoden til to-hybridanalyse beskrevet og anvendt af S. Fields og O. Song i 1989 [1] , da de studerede GAL4 - transkriptionsfaktoren i gæren Saccharomyces cerevisiae . Men siden da er princippet om påvisning af protein-protein-interaktioner ved hjælp af GAL4 - transkriptionsaktivator blevet tilpasset til at skabe andre alternative metoder, herunder nogle, der er i stand til at påvise DNA-protein- og DNA-DNA-interaktioner, såvel som multi-proteinkomplekser.
Udover gær anvendes der også Escherichia coli [2] og pattedyrceller .
Metoden til to-hybridanalyse er baseret på de strukturelle træk ved GAL - genpromotorerne , der koder for proteinet galactosidase . Promotorerne af disse gener består af TATA-boksen , UAS-aktivatorsekvensen og Inr - initieringsmotivet . Forekomsten af galactose i cellen fører til konformationelle ændringer i regulatoriske proteiner , hvilket gør det muligt for Gal4p-proteinet at begynde at fungere som en aktivator på forskellige GAL-promotorer [3] .
Transkriptionsaktivatoren GAL4p er et endogent udtrykt protein 881 a.a. langt, indeholdende 2 domæner : DNA-binding (1-147 a.a.) og aktivator (771-881 a.a.). I naturlige transkriptionsfaktorer er disse domæner dele af en enkelt proteinkugle, men de kan også syntetiseres separat, mens de bevarer deres oprindelige funktioner.
Som et eksempel beskriver vi enheden til den klassiske to-hybrid-systemmetode, der bruges til at detektere interaktioner mellem proteiner. For at teste for tilstedeværelsen af interaktion mellem protein A og protein B skabes rekombinante molekyler , hvoraf det ene er protein A fusioneret til det DNA-bindende domæne (A-CD), og det andet er protein B fusioneret til aktivatordomænet ( B-AD). I sammensætningen af kimære proteiner bevarer domænerne deres funktioner. Hvert rekombinant molekyle er separat ikke i stand til at forårsage aktivering af transkription , men da det er tæt på, muligvis på grund af interaktionen mellem protein A og B, genskabes den oprindelige funktion af GAL4p-proteinet, og reportergenet aktiveres [4 ] [5] .
Gær to-hybrin screening bruger ofte genetisk modificerede gærstammer, der mangler biosyntesen af visse næringsstoffer (typisk aminosyrer eller nukleinsyrer ). Sådanne stammer kaldes auxotrofe . Når den dyrkes på medier , der mangler disse næringsstoffer, vil gæren dø. Dernæst transficeres to auxotrofe stammer med plasmider , hvori galactosidasepromotoren regulerer transkriptionen af genet, der koder for det manglende metaboliske pathway -element . Et plasmid vil også indeholde genet for protein A fusioneret til SD. I dette tilfælde er protein A normalt kendt. Det andet plasmid vil indeholde AD-fusion B-proteingenet. I dette tilfælde kan protein B enten være et protein med en ukendt funktion, muligheden for binding til protein A skal kontrolleres, eller i stedet for ét plasmid med B-AD fusionsproteingenet kan der være et helt bibliotek af forskellige plasmider indeholdende gener for forskellige proteiner fusioneret med AD. Proteinbiblioteket screenes således for muligheden for interaktion med protein A. Fremgangsmåder, der anvender biblioteket, antager, at kun et par plasmider kommer ind i cellen, der undersøges, således at hver celle ikke producerer mere end ét protein fra biblioteket. Derefter krydses to auxotrofe stammer [2] . I den resulterende hybrid bliver AD- og SD-domæner indirekte forbundet efter vellykket interaktion mellem A og B, og AD er i umiddelbar nærhed af transskriptionsstartstedet for reportergenet. Den resulterende stamme vil ikke være auxotrof. I fravær af interaktion er der ingen transkription, hybriden er auxotrophen. Derfor er vellykket interaktion forbundet med en ændring i den cellulære fænotype .
To-hybrid analyse kræver ikke specielt dyrt udstyr og tillader analyse af hele biblioteker. En væsentlig ulempe ved denne metode er imidlertid et stort antal falsk-positive resultater .
Denne metode er baseret på de samme principper som to-hybridsystemet, med den forskel at protein A og B ikke interagerer direkte med hinanden. Mellem dem er der et tredje grundstof - stof X. Dette stof kan være et DNA- eller RNA- molekyle , en lille organisk ligand , en inhibitor , der kovalent binder til enzymets aktive center . Metoden gør det muligt at identificere NK -protein- interaktioner, enzymatisk aktivitet i forhold til et givet substrat , interaktionen af et protein med små molekyler [4] .
Den væsentligste forskel fra det "direkte" to-hybrid system her er, at det gen, hvis ekspression er reguleret af dette system, er dødeligt. Hvis der er en interaktion mellem protein A og B, vil hybridorganismen således dø. Denne metode bruges til at bestemme de aminosyrerester, der er nødvendige for interaktionen mellem kuglerne A og B [4] .
I denne modifikation af den klassiske metode er der kun ét rekombinant molekyle, AD-A-B-SD. I dette tilfælde indsættes en kendt DNA -sekvens før reportergenet , BD varierer. På den måde er det muligt at bestemme, hvilke proteiner der binder sig til en given DNA-sekvens [4] .
Det antages, at enhver levende celle kan bruges til at implementere et to-hybrid system, dog er der praktiske overvejelser omkring den lave pris og stabilitet af den valgte cellelinje [6] .
Historisk set er den første organisme for et to-hybrid system gær . Gær er en stabil, enkel og velundersøgt modelorganisme . Gærceller opretholder neutrale pH -værdier inde i cellen på trods af sure pH -værdier i det ydre miljø. Gær er også svagt følsomme over for ekstracellulære toksiner, de kan manipuleres uden at bruge molekylære metoder [7] Det er vigtigt at bemærke behovet for nukleare lokaliseringssignaler , da hele det genetiske apparat af gær er lokaliseret i kernen. I deres fravær vil et potentielt interagerende par af proteiner ikke blive oversat og vil ikke interagere.
Bakteriesystemer kan bruges på samme måde som gærsystemer. De har åbenbart mere potentiale og er mere at foretrække til at bruge et to-hybrid system. Bakteriesystemer tillader brug og analyse af biblioteker større end 108 , har en hurtigere væksthastighed og større potentiale for små molekyler permeabilitet. Der er heller ikke behov for nukleare lokaliseringssignaler , og det bliver muligt at studere proteiner, der er giftige for gær. På grund af hurtigere selektive metoder sikres en lav falsk positiv rate (3·10 −8 ) [6] .
Når man studerer proteiners interaktion, er det muligt at identificere nye funktioner. Ved at bruge et kendt A 0 - protein , et bibliotek af ukendte B n - proteiner og efterfølgende sammenligning med et tidligere kendt par af A 0 B 0 - interagerende proteiner , kan man få information om ligheden mellem B n og B 0 . Lignende data kan opnås ved at studere interaktionerne af et kendt bibliotek af proteiner med et enkelt protein med en ukendt funktion [7] .
To-hybridsystemet bruges, når det for et par kendte og interagerende proteiner er nødvendigt at bestemme de aminosyrerester, der danner området for deres interaktion. For at gøre dette udføres mutationer i DNA-baseparrene svarende til specifikke aminosyrer i de anvendte plasmider . Der dannes således et bibliotek med punktændringer i aminosyrerester, på baggrund af hvilket det ved hjælp af et to-hybrid system er muligt at bestemme betydningen af en bestemt aminosyre i dannelsen af interaktion med et partnerprotein [7 ] .
Moderne metoder gør det muligt at konstruere en celle valgt til undersøgelse på en sådan måde, at den afspejler et eller andet molekylært aspekt valgt til undersøgelse. I sådanne celler bliver det muligt at teste specificiteten og nøjagtigheden af lægemiddellevering medieret af to-hybridsystemet, hvilket giver dig mulighed for hurtigt at løse problemerne med nye bivirkninger.
En lignende tilgang bruges til toksiner og giftstoffer [7] .
For at søge efter zinkfingerproteiner (zinkfingerproteiner eller ZFP'er) er metoder baseret på to-hybrid-analyse blevet anvendt med succes [2] . Som et DNA-bindende protein bruges ZFP til at skabe ikke-standard DNA-bindende domæner, der koordinerer til en forudbestemt region af DNA-sekvensen.
Metoden er baseret på oprettelsen af et ZFP -bibliotek ved tilfældigt at ændre visse aminosyrerester. Yderligere er dem, der er i stand til at interagere med målstedet inkluderet i UAS, udvalgt blandt dem, svarende til de krævede karakteristika. Hver ZFP genkender dog kun en lille strækning af DNA, omkring 3-4 baser, så et kompleks bestående af to ZFP'er med en konstant sekvens bruges til at forbedre bindingsnøjagtigheden og forhindre genkendelse af steder uden for UAS . ZFP'er fra et sådant kompleks binder ved kanterne af målområdet og forhindrer binding uden for UAS [2] .
En række andre DNA-bindingsdomæner kan også undersøges ved anvendelse af dette system.