Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) er en molekylærbiologisk metode, der giver dig mulighed for at bestemme interaktionerne (spatial nærhed) af kromatinregioner placeret i betydelig afstand fra hinanden i genomet . [1] Sådanne interaktioner er af interesse for bestemmelsen af regulatoriske elementer . Regulatoriske elementer i celler kan være lokaliseret i en betydelig afstand fra promotoren af det regulerede gen (for eksempel cis-regulatoriske elementer , trans-regulatoriske elementer , isolatorer , enhancere ). For at forstå mekanismerne for sådanne interaktioner er det nødvendigt at kende det rumlige arrangement af kromatinregioner i forhold til hinanden, hvilket denne metode gør det muligt at bestemme de novo . Til gengæld er den opnåede information vigtig for at forstå mekanismerne for regulering af genekspression . [2]
ChIA-PET er baseret på brugen af ChIP , 3C ( Chromosome Conformation Deermination ) og Paired -end tag- sekventering , hvor der anvendes high-throughput-sekventering og yderligere computerbehandling af resultaterne. [3]
Metoden blev første gang brugt i 2009 [1] til at bestemme fjerntliggende ER-alfa- bindingssteder i human brystkræft. Efterfølgende blev det fx brugt til at konstruere et interaktom (kort over mulige interaktioner) medieret af CTCF i embryonale musestamceller [4] .
ChIA-PET kombinerer mulighederne for både ChIP- og 3C [5] -baserede metoder , hvilket forbedrer hver enkelts muligheder. Den traditionelle ChIP-metode giver dig mulighed for at bestemme interaktionen af et bestemt protein med DNA og kan bruges til at søge efter transkriptionsfaktorbindingssteder . Ved anvendelse af ChIP-seq kan de novo - bindingssteder for proteinet af interesse bestemmes i hele genomet. Hvis et protein binder områder af kromatin, der er langt fra hinanden på kromosomet , men tæt i rummet, kan ChIP-seq identificere hver af dem, men indikerer ikke deres interaktion. Imidlertid er ikke alle sekvenser bestemt af ChIP-seq-metoden entydigt kortlagt i genomet, og ikke alle er funktionelle bindingssteder [6] .
3C og ChIA-PET metoderne er baseret på teorien om proksimal ligering ( proximity ligation ), som siger, at enderne af kromatinregionerne forbundet med proteinkomplekset, som er i nærheden, vil blive ligeret til hinanden med større sandsynlighed end enderne af regionerne i opløsning eller forbundet med et andet proteinkompleks.
3C-metoden gør det muligt at bestemme den rumlige struktur af kromatin, men tillader ikke at bestemme det interagerende protein [5] . Et væsentligt problem er behovet for nøjagtig viden om rækkefølgen af interagerende loci . Dette er nødvendigt for udvælgelsen af primere til den kvantitative eller semi -kvantitative PCR-analyse , der bruges til at bestemme dem. (Det skal bemærkes, at der kan være flere loci - kandidater til interaktioner - bestemt ved 3C-metoden). ChIA-PET-metoden tillader de novo bestemmelse af den rumlige struktur af kromatin forbundet med et specifikt protein. Det vil sige, at det på den ene side ikke kræver viden om DNA-sekvensen i interaktionsområdet, og på den anden side afhænger det fuldstændig af specificiteten af de anvendte antistoffer .
| chip | ChIP seq | ChIA-PET | 3C | |
|---|---|---|---|---|
| Har brug for specifikke antistoffer | + | + | + | - |
| Det er nødvendigt at kende DNA-sekvensen på det undersøgte locus | + | - | - | + |
| Referencegenom påkrævet | - | + | + | - |
| Metoden giver information om | Bindingssteder | Om de novo bindingssteder |
Om de novo bindingssteder + kromatinkonformation |
Kromatin konformationer |
DNA-proteinkomplekser er tværbundet uspecifikt med formaldehyd. Prøven udsættes for ultralyd , mens DNA-molekyler knuses til fragmenter og løst bundne uspecifikke komplekser ødelægges. Som et resultat opnås DNA-fragmenter i stærke komplekser med proteiner. Yderligere, ved hjælp af specifikke antistoffer fikseret på magnetiske perler, udfældes kromatinfragmenter forbundet med proteinet af interesse. Ofte er genstandene for undersøgelsen kendte transkriptionsfaktorer [1] . Udfældede komplekser fjernes fra opløsningen ved hjælp af magnetiske perler under anvendelse af en magnet. De isolerede komplekser opdeles i 2 portioner, og oligonukleotid-semi- linkere med en kendt sekvens "syes" til enderne af DNA-molekylerne . Halvlinker A er i den ene alikvot, og halvlinker B er i den anden. Begge halvlinkere indeholder det sted , der genkendes af MmeI restriktionsenzymet og adskiller sig fra hinanden ved en "stregkode" af to nukleotider : CG for halv- linker A og AT for halvlinker B. Som et resultat, senere, under sekventering, kan linkerne skelnes fra hinanden ved "stregkoden". I det næste trin kombineres to alikvoter, og proksimal ligering sker, hvorved halvlinkerne ligeres oven på hinanden for at danne fuldlængde linkere. Linkere med AA (CG/CG) eller BB (AT/AT) "stregkoder" betragtes som sandsynlige ligeringsprodukter inden for det samme kompleks, mens linkere med AB (CG/AT) "stregkoder" betragtes som kimære ligeringsprodukter af DNA forbundet med forskellige proteinkomplekser Forberedelse til sekventering involverer bearbejdning af komplekserne med MmeI restriktionsenzym [8] , som spalter DNA i en vis afstand fra dets genkendelsessted i halvlinkeren. Som et resultat opnås ved slutningen af dette trin konstruktioner indeholdende et par "tags" ( eng. tag ) (20 bp hver) på begge sider af den fulde linker (38 bp). De resulterende fragmenter sekventeres i begge ender ( PET ) . Mærkerne kortlægges derefter på genomet. [7] [9]
Computerbehandling af sekventeringsresultater omfatter 6 moduler [7] [10]
Alle læsesekvenser er opdelt i sekvenser med læsbare "stregkoder" og ulæselige "stregkoder". Hvis "stregkoden" ikke kan læses, så "kasseres" sekvensen fra behandling. Hvis "stregkoden" kan læses, justeres sekvenserne efter linkerene. Alle opnåede sekvenser er opdelt i kimære (dannet ved ligering af DNA fra forskellige komplekser og indeholdende A/B-linkeren) og ikke-kimæriske (indeholdende A/A- eller B/B-linkeren). Det skal bemærkes, at blandt de sekvenser, der indeholder A/A eller B/B, kan der også forekomme kimære. Endvidere "kasseres" sekvenserne af linkerne selv, og sekvenserne af "tags" (PET'er) analyseres. [7] [10]
Kortlægning af PET'erSekvenserne opnået i det foregående trin er kortlagt til referencegenomet. I det første trin isoleres 100 % alignede sekvenser , som kan kortlægges på ét locus (unik) eller på mange loci. Af de resterende sekvenser er dem, der indeholder 1 substitution i sekvensen ( engelsk missmatch ) med referencegenomet, isoleret, de er også opdelt i unikke og sekvenser med multiple mapping. Alle andre sekvenser er ikke-kortlagt. Alle sekvenser undtagen dem, der er unikt kortlagt, "kasseres" fra behandling. [7] [10]
Klassificering af PET'erDer er to grupper af PET'er: "selvligerede" ( engelsk selvligerede PET'er ) og "interligerede" ( engelsk interligerede PET'er ). "Selvligerede" ( engelsk selvligerings-PET'er ) svarer til enderne af et ChIP-DNA-fragment, de skal være placeret på det samme kromosom i kort afstand fra hinanden, i retningen "hoved til hale". "Interligerede" ( eng. inter-ligation PET'er ) er opdelt i intrakromosomale (kortlagt på det samme kromosom på stor afstand), interkromosomale (kortlagt på forskellige kromosomer) og ligeret i forskellige orienteringsmærker ( eng. forskellig orientering ligation PET'er ) (kortlagt på det samme kromosom på kort afstand, men i den forkerte orientering eller på forskellige DNA-strenge). Grænsen, der adskiller "selvligerede" PET'er fra "interligerede" PET'er, bestemmes naturligt af længden af DNA-fragmenterne opnået ved en given "lyd"-intensitet. I forskellige forsøg var det 3-4,6 Kb. [7] [10]
Bestemmelse af proteinbindingsstederSelvligeringsmærker ( selvligerings-PET'er ) bruges til at bestemme proteinbindingssteder . Fremgangsmåden ligner den, der anvendes i ChIP-seq .
Definition af kromatin-interaktionerI forudsigelsen af denne type interaktion anvendes " inter -ligerings" PET'er .
Visualisering og organisering af resultaterDataene fra de foregående trin indtastes i databaser til lagring, bearbejdning og eventuel visualisering.
Følgende computerprogrammer anvendes i ChIA-PET eksperimenter