Dot blotting
Dot blot er en teknik, der bruges i molekylærbiologi til at detektere forskellige makromolekyler såsom nukleinsyrer eller proteiner. Denne teknik er en vis forenkling af Western blot : prøver, der indeholder de undersøgte makromolekyler, påføres øjeblikkeligt på en nitrocellulose- eller PVDF-membran, idet de omgår stadiet med foreløbig elektroforese i PAAG (især når der arbejdes med proteiner).
Protokol til at arbejde med PVDF-membran
- Påfør testprøverne på den tørre PVDF-membran (1-3 µl opløsning pr. punkt). Når der arbejdes med en PVDF-membran, skal bufferen, som prøverne er opløst i, have en tilstrækkelig høj ionstyrke , ellers kan opløsningen simpelthen ikke trænge ind i membranen på grund af dens hydrofobe egenskaber.
- Membranen skal tørres. Normalt er 30 minutter ved stuetemperatur tilstrækkeligt.
- Placer membranen i buffer for at reducere ikke-specifikke antistofbindinger. Rollen som et middel, der reducerer ikke-specifikke interaktioner, udføres normalt af bovint serumalbumin (BSA) eller mælkepulver . 20 minutter - 1 time ved stuetemperatur.
- Placer membranen i primær antistofbuffer. BSA eller mælkepulver er også til stede i denne buffer, men i en mindre mængde. 1 time - TIL, T = 4 С°.
- Vask membranen 3 x 5 min.
- Placer membranen i en buffer indeholdende et sekundært antistof indeholdende et detektionsmiddel såsom peberrodsperoxidase . 1-2 timer ved stuetemperatur.
- Vask membranen igen i 3 x 5 min.
- Placer membranen i detektionsopløsningen. Det er bedre at tilføje 30% hydrogenperoxid til en kommerciel opløsning (ca. 10-50 µl pr. 10 ml opløsning). 1-3 minutter ved stuetemperatur.
- Opdagelse. I tilfælde af anvendelse af sekundære antistoffer med peberrodsperoxidase observeres kemiluminescerende stråling forårsaget af skæring af substratet fra detektionsopløsningen med peberrodsperoxidase. I tilfælde af brug af en enhed, der registrerer kemiluminescens, er en meget lille eksponering (op til 2 minutter) tilstrækkelig
Se også