Streptavidin / ˌstrɛpˈtævɪdɪn / er et 66,0 kDa ( tetramer ) protein , oprenset fra bakterien Streptomyces avidinii . _ _ _ _ _ Streptavidin-homotetramerer har en ekstrem høj affinitet for biotin (også kendt som vitamin B 7 eller vitamin H). Med en dissociationskonstant (Kd ) af størrelsesordenen ≈10 -14 mol/l [1] er bindingen af biotin til streptavidin en af de stærkeste ikke-kovalente interaktioner, der er kendt i naturen. Streptavidin er meget udbredt inden for molekylærbiologi og bionanoteknologi på grund af streptavidin-biotin-kompleksets resistens over for organiske opløsningsmidler, denatureringsmidler (f.eks. guanidiniumchlorid ), detergenter (f.eks. SDS , Triton X-100 ), proteolytiske enzymer og temperatur- og pH-ekstremer.
Krystalstrukturen af streptavidin bundet til biotin blev beskrevet af to grupper i 1989. Strukturen blev løst ved anvendelse af anomal diffraktion med flere bølgelængder af Hendrickson et al. [2] ved Columbia University og ved hjælp af multipel isomorf substitution af Weber et al. [3] hos EI DuPont Central Research and Development. Per september 2017 er 171 strukturer deponeret i Proteindatabanken . Se dette link for den fulde liste . N- og C-termini af proteinet med 159 rester i fuld længde bearbejdes til dannelse af en kortere "kerne"-streptavidin, typisk bestående af resterne 13-139; fjernelse af N- og C-termini er nødvendig for at opnå den højeste bindingsaffinitet for biotin. Den sekundære struktur af streptavidinmonomeren består af otte antiparallelle β-strenge, der folder for at danne en antiparallel β-tønde tertiær struktur. Biotinbindingsstedet er placeret i den ene ende af hver β-tønde. Fire identiske streptavidinmonomerer (dvs. fire identiske β-stammer) binder til dannelse af den streptavidin tetramere kvaternære struktur. Biotinbindingsstedet i hver stilk består af rester fra det indre af stilken sammen med konserveret Trp120 fra den tilstødende underenhed. Hver underenhed bidrager således til bindingsstedet for den tilstødende underenhed, og derfor kan tetrameren også betragtes som en dimer af funktionelle dimerer.
Talrige krystalstrukturer af streptavidin-biotin-komplekset har kastet lys over oprindelsen af denne bemærkelsesværdige affinitet. For det første er der en høj komplementaritet i formen mellem bindingslommen og biotin. For det andet er der et omfattende netværk af hydrogenbindinger dannet med biotin på bindingsstedet. Der er otte hydrogenbindinger direkte til rester på bindingsstedet (den såkaldte "første skal" af hydrogenbindinger), herunder resterne Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 og Asp128. Der er også en "anden skal" af hydrogenbindinger, inklusive rester, der interagerer med de første skalrester. Streptavidins affinitet til biotin overstiger imidlertid den, som ville blive forudsagt ud fra hydrogenbindingsinteraktioner alene, hvilket indikerer en anden mekanisme, der bidrager til den høje affinitet [4] . Den biotinbindende lomme er hydrofob , og der er talrige van der Waals-medierede kontakter og hydrofobe interaktioner med biotin, når det er i lommen, hvilket også menes at forklare den høje affinitet. Især er lommen foret med konserverede tryptofanrester. Endelig er biotinbinding ledsaget af stabiliseringen af en fleksibel løkke, der forbinder β-strenge 3 og 4 (L3/4), som lukker over det bundne biotin, fungerer som et "låg" over bindingslommen og tillader den ekstremt langsomme frigivelse af biotin. dissociationshastighed.
De fleste forsøg på at mutere streptavidin resulterer i et fald i biotinbindingsaffinitet, hvilket kan forventes i et sådant optimeret system. En nyoprettet streptavidin-mutant ved navn traptavidin viste sig imidlertid at dissociere biotin mere end ti gange langsommere, foruden højere termisk og mekanisk stabilitet [5] . Dette fald i dissociationsraten blev ledsaget af et dobbelt fald i associationsraten.
Biotin-bindingsaffinitet kan afbrydes ved kemisk mærkning af streptavidin, såsom med amino-reaktive fluoroforer ; flavidin er en streptavidinmutant uden lysinsidekæder, der bevarer gode biotinbindingsegenskaber efter at være blevet mærket med et fluorescerende farvestof, når farvestoffet kobles til aminoterminalen [6] .
Blandt de mest almindelige anvendelser af streptavidin er oprensning eller påvisning af forskellige biomolekyler. Den stærke vekselvirkning mellem streptavidin og biotin kan bruges til at binde forskellige biomolekyler til hinanden eller til et fast underlag. Strenge betingelser er nødvendige for at forstyrre streptavidin-biotin-interaktionen, som ofte denaturerer proteinet af interesse, der renses. Det er imidlertid blevet vist, at en kort inkubation i vand over 70°C reversibelt vil forstyrre interaktionen (i det mindste for biotinyleret DNA) uden streptavidin-denaturering, hvilket gør det muligt at genbruge streptavidin-faststoffet [7] . En anden anvendelse af streptavidin er oprensning og påvisning af proteiner, der er genetisk modificeret med Strep-tag- peptidet . Streptavidin er meget udbredt i Western blotting og immunoassays konjugeret til nogle reportermolekyler såsom peberrodsperoxidase . Streptavidin er også blevet brugt i det nye område af nanobioteknologi , ved at bruge biologiske molekyler såsom proteiner eller lipider til at skabe enheder/strukturer i nanoskala . I denne sammenhæng kan streptavidin bruges som en byggesten til at binde biotinylerede DNA-molekyler til at skabe stilladser fra enkeltvæggede kulstofnanorør [8] eller endda komplekse DNA-polyedre [9] . Tetramerisk streptavidin er også blevet brugt som et center, omkring hvilket andre proteiner kan placeres enten ved et affinitetsmærke såsom Strep-tag eller AviTag eller ved genetisk fusion med SpyTag [10] . Fusionen med SpyTag tillod oprettelsen af samlinger med 8 eller 20 streptavidin-underenheder. Sammen med molekylærkraftsonden til atomkraftmikroskopistudier [11] er der også skabt nye materialer, såsom tredimensionelle krystalgitre [12] . Streptavidin har et svagt surt isoelektrisk punkt (pI) på ~5, men en rekombinant form for streptavidin med en næsten neutral pI er også kommercielt tilgængelig.
Forudmålrettet immunterapiPræ-målrettet immunterapi bruger streptavidin konjugeret til et monoklonalt antistof mod cancerspecifikke antigener, efterfulgt af injektion af radioaktivt mærket biotin for kun at levere stråling til kræftcellen. Indledende forhindringer omfatter mætning af biotinbindingsstederne på streptavidin med endogent biotin i stedet for det administrerede radioaktivt mærkede biotin og en høj grad af radioaktiv eksponering for nyrerne på grund af streptavidins stærke adsorptionsegenskaber på celler. Dette høje niveau af binding til adhærente celletyper såsom aktiverede blodplader og melanomer menes nu at skyldes integrinbinding medieret af RYD-sekvensen i streptavidin [13] .
Streptavidin er en tetramer, og hver underenhed binder biotin med samme affinitet. Multivalens er en fordel i applikationer som MHC-tetramerfarvning , hvor aviditetseffekter forbedrer evnen af MHC-molekyler knyttet til streptavidin til at påvise specifikke T-celler [14] . I andre tilfælde, såsom brugen af streptavidin til at visualisere specifikke proteiner på celler, kan polyvalens forringe funktionen af proteinet af interesse. Monovalent streptavidin er en konstrueret rekombinant form af streptavidin, som er en tetramer, men kun et af de fire bindingssteder er funktionelt. Dette enkelte bindingssted har en affinitet på 10-14 mol/l og kan ikke forårsage tværbinding [15] . Anvendelser af monovalent streptavidin har inkluderet fluorescenssporing af celleoverfladereceptorer , DNA-origami - dekoration og fungering som en pege på at identificere specifikke områder til kryoelektronmikroskopi .
Monomer streptavidin er en rekombinant form af streptavidin med mutationer for at spalte tetrameren til monomer og øge opløseligheden af den resulterende isolerede underenhed. De monomere versioner af streptavidin har en affinitet for biotin på 10 −7 mol/l 10 −8 mol/l og er derfor ikke ideelle til mærkning, men er anvendelige til oprensning, hvor reversibilitet ønskes [16] [17] .
DivalentStreptavidin med præcis to biotinbindingssteder pr. tetramer kan fremstilles ved at blande underenheder med og uden et funktionelt biotinbindingssted og rense ved ionbytterkromatografi . De funktionelle bindingssteder her har samme biotinbindingsstabilitet som vildtype streptavidin. Divalent streptavidin med to biotinbindingssteder sammen (cis-bivalent) eller separat (trans-bivalent) kan oprenses separat [18] .
TrivalentStreptavidin med præcis tre biotinbindingssteder pr. tetramer kan også fremstilles efter samme princip som for divalente streptavidiner [19] .
Streptavidiner med høj valensStreptavidiner med højere valens er blevet genereret ved hjælp af isopeptidbindingskonjugationskemi ved hjælp af SpyTag/SpyCatcher-teknologi [20] . Dette tyder på en streptavidin-tetramer med tre biotinbindingssteder og død streptavidin fusioneret til enten SpyTag eller SpyCatcher. Når forskellige tetramerer blandes sammen, dannes en kovalent binding, der giver flere biotinbindingssteder. Med denne metode blev der skabt seks og tolv biotinbindingssteder pr. molekyle.
Streptavidin er ikke det eneste protein, der kan binde biotin med høj affinitet. Avidin er det andet mest kendte biotinbindende protein. Oprindeligt isoleret fra æggeblomme har avidin kun 30% sekvensidentitet med streptavidin, men næsten identisk sekundær, tertiær og kvaternær struktur. Avidin har en højere affinitet for biotin ( Kd ~ 10-15 M ), men i modsætning til streptavidin er avidin glycosyleret, positivt ladet og har pseudokatalytisk aktivitet (avidin kan øge den alkaliske hydrolyse af esterbindingen mellem biotin og nitrophenyl). gruppe) og har en højere tendens til at aggregere. På den anden side er streptavidin det bedste bindemiddel til biotinkonjugat; avidin har en lavere bindingsaffinitet end streptavidin, når biotin er konjugeret til et andet molekyle, på trods af at avidin har en højere affinitet til frit, ukonjugeret biotin. Fordi streptavidin ikke har nogen kulhydratmodifikation og har en næsten neutral pi , har den fordelen af meget lavere ikke-specifik binding end avidin. Deglycosyleret avidin (NeutrAvidin) er mere sammenlignelig i størrelse, pI og ikke-specifik binding til streptavidin.
Grupper, der forsker i og udvikler streptavidin- eller avidinfamilieproteiner (i alfabetisk rækkefølge)