Fluorescens anisotropi

Fluorescensanisotropi (fluorescenspolarisering ) er  et fysisk fænomen, der består af forskellige lysintensiteter udsendt af en fluorofor langs forskellige polarisationsakser . Pionerer inden for forskning inden for dette videnskabsområde var Alexander Yablonsky , Gregorio Weber [1] og Andreas Albrecht [2] . Metoder baseret på analyse af fluorescenspolarisering er almindeligt anvendt til screening af forbindelser med lille molekylvægtinteragerer med proteiner, og i studiet af proteiners struktur.

Metodeprincip

Fænomenet fluorescens er baseret på overgangen af ​​et molekyle til en exciteret tilstand ved absorption af en foton . Efter en kort forsinkelse (den karakteristiske fluorescenstid τ ), vender molekylet tilbage til grundtilstanden , og afgiver en del af energien i form af varme og udsender endnu en foton. Under disse begivenheder omfordeles molekylets elektroner . I denne henseende er excitation af en foton kun mulig med en vis orientering af lysets elektriske feltvektor i forhold til molekylet, og den udsendte foton er polariseret på en bestemt måde i forhold til molekylet.

Hvis en gruppe af fluoroforer belyses med polariseret lys, vil de molekyler, der er orienteret i et bestemt vinklerområde i forhold til polarisationsplanet, gå ind i den exciterede tilstand. Hvis de er stationære, vil det udsendte lys også blive polariseret i en bestemt vinkel. Denne iboende anisotropi ( r 0 ) måles normalt ved at inkorporere fluoroforer i en frossen polyvalent alkohol .

Graden af ​​polarisering af det udsendte lys kan reduceres, hvis fluoroforerne er frie til at rotere. Graden af ​​fald i korrelationen mellem polariseringen af ​​absorberet og udsendt lys afhænger af forholdet mellem den karakteristiske ændringstid i den rumlige orientering af fluoroforen ϕ og den karakteristiske fluorescenstid τ . Årsagen til ændringen i orienteringen af ​​fluoroforen kan enten være rotationen af ​​hele molekylet eller rotationen af ​​kun dets fragment, der indeholder fluoroforen. Målingen af ​​anisotropi er relateret til rotationshastigheden ved følgende relation:

,

hvor r  er den observerede anisotropi, r0 er molekylets iboende  anisotropi, τ  er den karakteristiske fluorescenstid, og ϕ  er den karakteristiske rotationstid.

Et sådant ræsonnement er kun anvendeligt, når fluoroforerne er langt nok fra hinanden. Hvis de er i nærheden, kan de udveksle energi på grund af Förster-resonans ( eng.  FRET ), hvilket fører til et fald i den observerede anisotropi eller til et stærkere fald i korrelationen. Denne implementering af FRET omtales som emFRET (energy migration FRET).

Ansøgning

Fluorescensanisotropi kan bruges til at bestemme bindingskonstanter eller studere kinetikken af ​​reaktioner ledsaget af ændringer i molekylernes rotationstider. For eksempel, hvis en fluorofor er knyttet til et lille molekyle, kan dens rotationshastighed reduceres betydeligt, når den binder til et protein. Hvis fluoroforen er knyttet til et større molekyle, vil forskellen i polarisering mellem den frie og bundne tilstand være mindre (inklusive på grund af det store molekyles oprindeligt lave rotationshastighed), hvilket vil føre til et fald i målenøjagtigheden. Graden af ​​binding bestemmes af ændringen i anisotropi mellem frie, delvist bundne og fuldt bundne (i overskud af protein) tilstande ved titrering .

Hvis fluoroforen er knyttet til et stort molekyle som et protein eller RNA , kan dens ændring i mobilitet under foldning bruges til at studere foldningsdynamik.

I mikroskopi kan fænomenet fluorescenspolarisering anvendes til at studere den lokale viskositet af cytosolen eller membranerne , for at bestemme den lokale mikrostruktur af membraner eller lipidsammensætningen . Dette bruger polarisatorer placeret efter lyskilden og foran kameraet. Denne teknik kan også bruges til at studere interaktionen mellem molekyler i signalkaskader som reaktion på forskellige påvirkninger.

EmFRET - fænomenet og det associerede fald i anisotropi kan bruges i studiet proteinaggregering .

Noter

  1. ↑ Weber, G., 1953. Roterende Brownsk bevægelse og polarisering af opløsningers fluorescens. Adv. proteinkem. 8:415-459
  2. ↑ Albrecht, A., 1961. Polariseringer og tildelinger af overgange: metoden til fotoselektion. J. Mol. Spectrosc. 6:84-108.

Litteratur