| TEV protease | |
|---|---|
| Identifikatorer | |
| Kode KF | 3.4.22.44 |
| CAS nummer | 139946-51-3 |
| Enzymdatabaser | |
| IntEnz | IntEnz visning |
| BRENDA | BRENDA indgang |
| ExPASy | NiceZyme udsigt |
| MetaCyc | metabolisk vej |
| KEGG | KEGG indgang |
| PRIAM | profil |
| FBF strukturer | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum |
| Søg | |
| PMC | artikler |
| PubMed | artikler |
| NCBI | NCBI proteiner |
| CAS | 139946-51-3 |
| Mediefiler på Wikimedia Commons | |
TEV-protease (fra det engelske Tobacco E tch Virus - tobacco engraving virus ) er en meget specifik cysteinprotease fra tobaksgraveringsvirussen. Tilhører PA- superfamilien af chymotrypsin-lignende proteaser. På grund af dets høje sekvensspecificitet bruges det ofte til kontrolleret fordøjelse af fusionsproteiner in vitro og in vivo . [en]
Hele tobaksætsvirusgenomet koder for et enkelt massivt polyprotein (350 kDa), der spaltes i funktionelle blokke af tre proteaser: P1-protease (1 spaltningssted), HC-Pro (1 spaltningssted) og TEV-protease (7 spaltningssteder) . [2] Den native protease indeholder også et internt selvspaltningssted. Dette sted spaltes langsomt for at inaktivere enzymet (den fysiologiske årsag hertil er ukendt).
Strukturen af TEV-proteasen er blevet bestemt ved hjælp af røntgenkrystallografi . [3] Enzymet består af to β-cylindre og en fleksibel C-terminal, som viser strukturel homologi med superfamilien af trypsinproteinaser (PA-klan, C4-familie ifølge MEROPS-klassifikationen). [4] På trods af homologien til serinproteaser (såsom trypsin , elastase, thrombin , etc.), bruger TEV-proteasen cystein som et katalytisk sted [5] (som mange andre virale proteaser).
Kovalent katalyse sker via en Asp-His-Cys-triade opdelt mellem to β-cylindre (Asp er på β1 og His og Cys er på β2). [6] Substratet holdes i et β-ark, der danner en anti-parallel vekselvirkning med rillen mellem de to cylindre og en parallel vekselvirkning med C-terminalen. [7] Enzymet danner således en bindingstunnel omkring substratet, og sidekædeinteraktioner giver specificitet. [3]
Den naturlige spaltningssekvens blev først bestemt ved at undersøge spaltningsstederne i det native polyproteinsubstrat for gentagelsessekvensen. Konsensussekvensen for det native spaltningssted er ENLYFQ\S (hvor '\' angiver en spaltelig peptidbinding). [8] Aminosyrerester af substratet er nummereret fra P6 til P1 før spaltningsstedet og P1' efter udskæringen. Tidligt arbejde evaluerede også spaltningen af en række lignende substrater for at bestemme, hvor specifikt enzymet ville spalte den native sekvens. [9] [10]
Undersøgelser anvendte efterfølgende sekventering af spaltelige substrater fra en pulje af randomiserede sekvenser til at bestemme foretrukne mønstre. [11] [12] Selvom ENLYFQ\S er den optimale sekvens, er proteasen mere eller mindre aktiv på forskellige substrater (dvs. udviser en vis variabilitet). Den mest effektive spaltning forekommer i sekvenser, der ligner EXLYΦQ\φ-konsensus, hvor X er en hvilken som helst aminosyrerest, Φ er enhver stor eller mellemstor hydrofob rest, og φ er enhver lille hydrofob eller polær aminosyrerest.
Specificitet tilvejebringes af et stort kontaktareal mellem enzymet og substratet. Proteaser såsom trypsin er specifikke for en aminosyrerest før og efter den spaltelige binding ved et lavt bindingsgab med kun en eller to lommer, der binder sidekæderne af substratet. Omvendt har virale proteaser såsom TEV-protease en lang C-terminal hale, der fuldstændigt omslutter substratet for at skabe en bindingstunnel. Denne tunnel indeholder et sæt bindingslommer, således at hver sidekæde af peptidsubstratet (P6 til P1') binder til et komplementært sted (C6 til Cl'). [3]
Især peptidsidekæden af P6-Glu kontakter et netværk af tre hydrogenbindinger; P5-Asn peger på et opløsningsmiddel uden at skabe specifikke interaktioner (af denne grund er der ingen konsensus om sekvensen af substratet i denne position); P4-Leu dykker ned i en hydrofob lomme; P3-Tyr holdes i en hydrofob lomme med en kort hydrogenbinding for enden; P2-Phe er også omgivet af hydrofobe rester, herunder overfladen af histidintriaden; P1-Gln danner fire hydrogenbindinger; og P1'-Ser er kun delvist indesluttet i en lavvandet hydrofob rille. [3]
En af de vigtigste anvendelser af dette enzym er fjernelse af affinitetsmærker fra oprensede fusionsproteinpræparater . Årsagen til at bruge TEV-protease som et biokemisk værktøj er dens høje sekvensspecificitet. Dette gør det relativt ikke-toksisk in vivo , da sekvensen det genkender næsten aldrig findes i proteiner. [13]
Selvom rationelt design har haft begrænset succes med at ændre specificiteten af proteasen, er styret evolution blevet brugt til at ændre den foretrukne rest før [14] eller efter [15] [16] spaltningsstedet.
TEV-protease har begrænsninger i dets anvendelse. Det er tilbøjeligt til deaktivering ved selvspaltning, selvom dette kan undgås ved mutation S219V på det interne spaltningssted [17] . Proteasen udtrykt alene er dårligt opløselig; Der er gjort adskillige forsøg på at forbedre dets opløselighed gennem rettet evolution og computersimuleringer. Derudover er det vist, at ekspression kan forbedres ved fusion med et maltosebindende protein , hvilket øger partnerens opløselighed.
Molekylvægten af dette enzym varierer fra 25 til 27 kDa afhængigt af hvilken konstruktion der anvendes.