Mad2 (mitotisk deficient blocker 2) er et vigtigt spindel checkpoint protein . Spindel checkpoint systemet er et regulatorisk system, der hæmmer progressionen af overgangen fra metafase til anafase . Mad2 -genet blev først identificeret i gæren S. cerevisiae i en screening for gener muteret for at gøre dem modtagelige for mikrotubuli-gifte [1] . Humane ortologer af Mad2 ( MAD2L1 og MAD2L2 blev først isoleret på jagt efter humant cDNA , der reddede mikrotubulierne fra en giftmodtagelig gærstamme, der manglede et kinetochore -bindende protein [2] . Proteinet blev vist at være til stede i enlige kinetochorer og en antistofhæmningsundersøgelse viste, at det er essentielt for at blokere overgangen fra metafase til anafase som reaktion på nocodazolforgiftning af mikrotubuli.2 Siden isoleringen af Xenopus Laevis- ortologen svarende til humane sekvenser, er det blevet muligt at karakterisere det mitotiske kontrolpunkt i ægekstrakter .3
Progressionen fra metafase til anafase er præget af adskillelse af søsterkromatider . Cellecyklussporingsmekanismen , der forhindrer søsterkromatider i at adskille og gå ind i anafase, kaldes spindelkontrolpunktet. Som en foranstaltning mod kromosomfejl forsinker spindle assembly checkpoint (SAC) anafase, indtil alle par af søsterkromatider er blevet bipolære fastgjort.
Når mikrotubuli er knyttet til kinetochorer , justeres kromosomerne på metafasepladen, og biorientering er opnået, fjernes SAC-stopmekanismen. Indtræden i anafase medieres af aktiveringen af APCCdc20. APCCdc20 er en ubiquitin-proteinligase, der mærker et protein, securin, til destruktion. Destruktion af securin frigiver og aktiverer separase. Securin-bundet separase forbliver blokeret; men når hæmningen frigives, spalter den aktiverede separase cohesinkomplekset, der binder søsterkromatider sammen [5] .
Uden Cdc20 kan anafasestimuluskomplekset (APC) ikke aktiveres, og anafase forekommer ikke. Mad2 har vist sig at hæmme APC-aktivitet ved direkte fysisk interaktion [6] i et ternært kompleks med Cdc20 [7] . Kinetochorer, hvortil mikrotubuli forbliver knyttet, katalyserer Cdc20-sekvestrering af Mad2. Faktisk, når pattedyrsceller behandles med spindel-depolymeriseringsmidlet nocodazol i metafase , bliver MAD2-proteiner lokaliseret til kinetochorer af alle par af søsterkromatider [5] .
Mad2 er i stand til at danne multimerer og vedtager mindst to strukturelle konformationer . Åben Mad2 adskiller sig fra lukket Mad2 ved placeringen af de 50 rester af C-terminal segmentet. Dette "sikkerhedsbælte" blev presset tæt mod højre side af proteinet i en åben konformation. Når den er løsnet, kan sikkerhedsselen monteres igen af bindepartneren. I en lukket konformation vikler selen sig om den bundne ligand og interagerer med en anden region af Mad2. Mad2-bindingspartnere kan enten være Cdc20 eller Mad1. Mad1 og Cdc20 binder Mad2 på en identisk måde. Mad2 bruger det samme sted til at binde enten Mad1 eller Cdc20 og kan således kun binde et af de to proteiner ad gangen [5] .
Da enlige kinetochorer etablerer og vedligeholder SAC, rekrutteres Mad2 for at forhindre disse uordnede søsterkromatider i at separere . Når checkpoint-hæmningsprocessen aktiveres, binder Mad2 Mad1 og danner et lukket Mad2-Mad1-kompleks. I betragtning af at Mad1:Mad2 er et stabilt kompleks, og både CDC20 og MAD1 binder Mad2 på det samme bindingssted, er det højst usandsynligt, at en lukket Mad2 ville frigøre Mad1 til at binde til Cdc20.
Modellen, der forklarer Mad2-konformationen, der er i stand til at binde til Cdc20, er afhængig af den primære dannelse af Mad1-Mad2-kernekomplekset. I denne model rekrutteres den eksterne åbne Mad2 ind i Mad1:Mad2 matrixen. Denne Mad2:Mad2-interaktion er nødvendig for at løse de konformationelle ændringer, der tillader den åbne Mad2-bundne periferi at interagere med Cdc20. Cdc20:Mad2 nedbrydes derefter, og Mad1:Mad2 kan igen binde frit cytosolisk Mad2 [8] .
Det antages, at når først dannede Cdc20:Mad2-komplekser kan forstærke det anafaseventende signal , stimulere yderligere omdannelse af cytosolisk åben Mad2 og fri Cdc20 til Cdc20:lukket Mad2-kompleks. Denne spredning af signaludbredelse fra kinetochorekomplekser kan forklare, hvordan ledigheden af kun et lille kinetochorested fuldstændigt kan lukke metafasen til anafaseovergangen [9] .
Meget mangler at blive forklaret om spindel-checkpoint-signalering og bidraget fra andre spindel-checkpoint-samlingsproteiner såsom Bub1 , BubR1 og Bub3 . BubR1 og Bub3 kan også komplicere Cdc20, men det er endnu uvist, om disse proteiner letter binding af Cdc20 til at åbne Mad2 [9] .
Det er også meget uklart, hvordan p31comet modvirker checkpointet og fremmer Mad2-Cdc20-dissociation. De Antoni et al. foreslår, at i kombination med "Matrix Mad2", konkurrerer p31comet med åben Mad2 om binding til lukket Mad2: Mad1. Der udføres test for at kaste lys over, hvordan p31comet kan dæmpe spindelkontrolpunkter [10] .