Ion-halvleder-sekventering ( eng. Ion Semiconductor Sequencing ) er en metode til bestemmelse af DNA-sekvensen baseret på påvisning af hydrogenioner, der frigives under DNA-polymerisering. Dette er en "sekventering-på-syntese"-teknik, hvor en komplementær streng er konstrueret ud fra sekvensen af en skabelonstreng.
Mikrobrønde, der indeholder template-DNA-molekylet, der skal sekventeres, fyldes med én type deoxyribonukleotidtriphosphat (dNTP). Hvis det indførte dNTP er komplementært til templatens førende nukleotid, er det inkluderet i den voksende komplementære streng. Dette medfører frigivelse af brintioner, som udløser ISFET -ionsensoren , som indikerer, at der har fundet en reaktion sted. Hvis en gentagelse af et nukleotid er til stede i sekvensen af skabelonkæden, vil flere dNTP-molekyler blive knyttet i en cyklus. Dette fører til en stigning i antallet af dannede brintioner og et forholdsmæssigt højere elektrisk signal.
Denne teknologi adskiller sig fra andre sekventeringsteknologier ved, at den ikke bruger modificerede nukleotider og optiske sensorer. Ion-halvleder-sekventering kan også omtales som ion-torrent-sekventering, pH-medieret sekventering eller halvleder-sekventering. Udviklet af Ion Torrent Systems, Inc., blev teknologien licenseret fra DNA Electronics Ltd, [1] [2] og udgivet i februar 2010. [3] Ion Torrent placerede deres systemer som hurtige, kompakte og økonomiske sequencere velegnet til mange laboratorier som professionelle systemer. [4] Roches 454 Life Sciences samarbejder med DNA Electronics om at udvikle en kompakt, lang-sekvens-læsende DNA-platform ved hjælp af denne teknologi. [5]
Inkorporeringen af deoxyribonukleotidtriphosphat (dNTP) i den voksende DNA-kæde sker med dannelsen af en kovalent binding og frigivelsen af pyrophosphat og en positivt ladet hydrogenion. [1] [3] [6] dNTP vil kun blive inkluderet, hvis det er komplementært til skabelonstrengens ledende uparrede nukleotid. Ion-halvleder-sekventering er baseret på det faktum, at når en type dNTP erstattes af en anden, frigives en brint-ion.
Umodificerede A-, C-, G- eller T - dNTP'er fyldes sekventielt ind i hver mikrobrønd på en halvlederchip indeholdende et enkeltstrenget DNA-templatemolekyle, der skal sekventeres, og DNA-polymerase . [3] [7] [8] Hvis det indførte dNTP er komplementært til det næste uparrede nukleotid på skabelonstrengen, inkorporeres det i den voksende komplementære streng af DNA-polymerase. [9] Hvis det indførte dNTP ikke er komplementært, forekommer polymerisationsreaktionen ikke. Hydrogenionen, der frigives i reaktionen, ændrer opløsningens pH , som detekteres af ISFET . [1] [3] [7] Ikke-reagerede dNTP-molekyler vaskes ud før næste cyklus, når andre dNTP-arter introduceres. [7]
ISFET - sensorer er placeret under det ionfølsomme lag af mikrobrønde . [4] Alle lag er placeret på en CMOS-chip, svarende til dem, der i vid udstrækning anvendes i elektronikindustrien. [4] [10]
Hver chip indeholder en række mikrobrønde med tilsvarende ISFET- sensorer. En række elektriske impulser, der transmitteres fra en chip til en computer, omdannes til en DNA-sekvens uden mellemliggende signalkonvertering, [7] [11] da elektronik direkte registrerer hændelserne af nukleotidindeslutninger i kæden uden brug af mærkede nukleotider og optisk målinger. [4] [10] Signalbehandling og DNA-sekvenssamling kan udføres i software.
Nøjagtigheden af ion-halvleder-sekventering i februar 2011 var 99,6 % med et 50-nukleotidfragment (læst), 100 Mb pr. passage. [12] Fra februar 2011 var længden af de sekventerede fragmenter 100 basepar. [12] Nøjagtigheden af at læse gentagelser 5 nukleotider lange var 98%. [12] Disse data er endnu ikke blevet uafhængigt verificeret uden for virksomheden.
De vigtigste fordele ved ion-halvleder-sekventering er høj sekventeringshastighed med lave initiale investerings- og driftsomkostninger. [8] [11] Dette blev gjort muligt af fraværet af modificerede nukleotider og optiske målinger.
Fordi systemet registrerer hændelser af nukleotidtilsætninger lavet af naturlig polymerase, kan sekventering finde sted i realtid. Faktisk er sekventeringshastigheden begrænset af hastigheden for ændring af nukleotidsubstrat . [13] Ion Torrent Systems, udvikleren af teknologien, hævder, at målingen (fikseringen) af hver nukleotidtilsætning tager 4 sekunder, og hver kørsel varer omkring en time, hvor en sekvens på 100-200 nukleotider sekventeres. [11] [14] Fremskridt inden for halvlederchips (forudsagt af Moores lov ) tyder på, at antallet af aflæsninger pr. chip (og derfor pr. kørsel) bør stige. [elleve]
Anskaffelsesprisen for en pH-medieret sequencer fra Ion Torrent Systems, Inc. ved lanceringen var omkring $50.000, inklusive prøveforberedelsesudstyr og en server til dataanalyse. [8] [11] [14] Omkostningerne pr. kørsel er også væsentligt lavere end alternative automatiserede sekventeringsmetoder på omkring $1.000. [8] [12]
Hvis en homopolymer bestående af gentagelser af det samme nukleotid (f.eks. GGGGG) er til stede på skabelonstrengen (der skal sekventeres), bindes flere nukleotider på én gang, og flere hydrogenioner dannes i en cyklus. Dette resulterer i en større ændring i pH og et forholdsmæssigt højere elektronisk signal. [11] Begrænsningen ved dette system er, at det er svært at beregne længden af gentagelsen. Denne begrænsning deles af andre metoder, der detekterer enkeltnukleotid-insertioner, såsom pyrosequencing . [15] Signaler genereret af en lang gentagelse er svære at skelne fra lignende af andre længder, for eksempel er en 7 nukleotider lang gentagelse svær at skelne fra en 8 nukleotider lang homogentagelse.
Der var også en signifikant tilstedeværelse af sekventeringsfejl i form af enkeltnukleotidinsertioner og deletioner, sædvanligvis i den heterozygote tilstand. For at løse dette problem har Life Technologies udgivet en opdatering til Ion Reporter-softwareproduktet.
En anden ulempe ved dette system er den korte læselængde sammenlignet med andre sekventeringsmetoder såsom Sanger-sekventering eller pyrosequencing . Store læsefragmentlængder er nyttige til de novo -genomsamling . Til dato er læselængden opnået af Ion Torrent Systems, Inc. 600 basepar pr. pass. [3] [8] I øjeblikket er gennemløbet lavere end andre high-throughput sekventeringsteknologier, selvom udviklere håber at ændre dette ved at øge tætheden af mikrobrønde pr . chip . [3] I 2018 blev en ny serie af sequencere Ion GeneStudio S5 frigivet, som er sammenlignelig i ydeevne med andre helgenom-sekventeringsteknologier, mens de overgår dem i hastighed.
Ion-halvleder-sekventering er positioneret på markedet som en hurtig, kompakt og økonomisk sekventeringsmaskine, der kan bruges i en lang række laboratorier som en high-end maskine. [3] [4] Virksomheden håber, at deres system ikke kun vil blive brugt i specialiserede centre, men også på hospitaler og små universitets- og industrilaboratorier. En New York Times-artikel fra januar 2011, "Taking DNA Sequencing to the Masses," fremhæver denne ambition. [16]
Da alternative sekventeringsmetoder er i stand til at opnå længere læselængder (og derfor er mere egnede til helgenomanalyse ), kan denne teknologi være mest velegnet til anvendelser i lille skala såsom mikrobiel genomsekventering, mikrobiel transkriptomsekventering , målsekventering, amplikonsekventering eller til kvalitetstjek af bibliotekssekventering. [3] [8]