DNA markør

DNA-markører (DNA-markører), eller molekylærgenetiske markører, er et polymorfisk træk, der detekteres ved molekylærbiologiske metoder på niveauet af DNA- nukleotidsekvensen for et specifikt gen eller for enhver anden del af kromosomet , når man sammenligner genotyperne af forskellige individer, racer , sorter, linjer.

I de senere år er der blevet akkumuleret en masse data om effektiviteten af ​​brugen af ​​molekylærgenetiske markører på niveau med både proteiner og DNA , RNA , til løsning af mange problemer med genetik, avl, bevarelse af biodiversitet, undersøgelse af evolutionens mekanismer, kromosomkortlægning, samt til frøproduktion og forædling.

De mest udbredte molekylærgenetiske markører kan betinget opdeles i følgende typer - markører af sektioner af strukturelle gener, der koder for aminosyresekvenser af proteiner ( elektroforetiske varianter af proteiner ), markører for ikke-kodende sektioner af strukturelle gener og markører for forskellige DNA sekvenser, hvis forhold til strukturelle gener normalt er ukendt - fordeling af korte gentagelser gennem genomet ( RAPD  - tilfældigt amplificeret polymorf DNA; ISSR  - omvendte gentagelser; AFLP  - restriktionssted polymorfisme ) og mikrosatellit loci ( tandem gentagelser med en elementær enhed længde på 2-6 nukleotider).

Der er en lang række moderne teknologier til påvisning af polymorfi på DNA-niveau, blandt hvilke følgende kan skelnes:

• restriktions - DNA-fragmentlængde polymorfianalyse (RFLP);
• polymorfianalyse ved anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR) og andre metoder baseret på DNA-amplifikation mellem gentagne sekvenser i genomisk DNA.

Markører baseret på DNA-prober

• RFLP (RFLP-markører, fra " restriktionsfragmentlængdepolymorfi "). Evaluering af polymorfi i længderne af restriktive DNA-fragmenter kan udføres på forskellige måder, men den mest traditionelle metode er at bruge blot-hybridisering) [1] . Denne metode omfatter isolering af DNA, opnåelse af restriktionsfragmenter, deres elektroforetiske adskillelse, overførsel til filtre, efterfulgt af hybridisering af specifikke DNA-prober med de opnåede DNA-fragmenter. En DNA-probe er en relativt kort sekvens af klonet DNA med et vist niveau af homologi og evnen til at hybridisere med den tilsvarende region af genomisk DNA. Kombinationer af restriktionsenzymer og prober giver meget reproducerbare polymorfe spektre af DNA-fragmenter, der er specifikke for hvert individ. Forskelle mellem sidstnævnte kan for eksempel skyldes mutationer, der ændrer restriktionsstedet. RFLP har en række vigtige fordele, herunder høj reproducerbarhed af spektre i forskellige laboratorier, co-dominant "adfærd" af markøren. RFLP er effektiv til genom-kortlægning og markerer gener for mange biologiske og økonomisk vigtige egenskaber.
• VNTR ( engelsk  Variable Number Tandem Repeat ) er en metode kaldet DNA-fingeraftryk ("fingeraftryk") [2] . Tandem-gentagelser er vidt udbredt i forskellige genomer og er meget polymorfe. Som et resultat af den høje variabilitet af disse DNA-regioner gør RFLP-analyse med prober for mikro- og minisatellitsekvenser det muligt at opnå højopløselige multilocus-spektre på populationsniveau. På grund af det meget høje niveau af polymorfi er denne tilgang i øjeblikket et godt værktøj til at analysere intra- og interpopulationsvariabilitet og bestemme genetiske afstande mellem grupper af organismer. VNTR allelvarianter nedarves codominant.

PCR-markører

Polymerasekædereaktionsmetoden ( PCR) involverer brugen af ​​specifikke primere og produktionen af ​​diskrete DNA-amplifikationsprodukter af individuelle sektioner af genomisk DNA. Et stort antal relaterede teknologier er bygget på dette princip. Den mest udbredte RAPD-teknologi er baseret på analyse af amplificerede polymorfe DNA-fragmenter ved hjælp af enkelte primere med en vilkårlig nukleotidsekvens [3] , [4] , [5] .

• SSR ( English  Simple Sequence Repeats ) - PCR med flankerende primere til en kort mini- eller mikrosatellit-gentagelse giver dig mulighed for at identificere markører med codominant nedarvning og er følgelig praktisk til at identificere heterozygoter for et givet locus. Et par PCR-flankeprimere tillader imidlertid kun at overveje én locus-polymorfi. For mange mikrosatellit loci er det ikke muligt at påvise polymorfi. Som regel er flankerende sekvenser for et givet mikrosatellit-locus artsspecifikke.
• RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) er en  polymerasekædereaktion, der anvender en enkelt kort (normalt 10-mer) primer med en vilkårlig nukleotidsekvens [6] , [7] . Primersekvensen er ikke absolut vilkårlig, men er begrænset af værdierne af GC-sammensætningen på 40-70% og den sproglige kompleksitet af nukleotidsekvensen på 50-100%. En enkelt primer eller flere RAPD-primere kan anvendes i RAPD. RAPD-produktet genereres ved amplifikation af et genomisk DNA-fragment flankeret af den inverterede sekvens af den anvendte primer. Metoden er universel til undersøgelser af forskellige arter, ved brug af de samme primere. Generelt vil en primer, der udviser høj polymorfi hos én art, også være effektiv i andre arter.
• ISSR ( Inter Simple Sequence Repeats ) [8] [9] er en   specialiseret version af RAPD-metoden, hvor primeren består af en mikrosatellitsekvens. Denne metode, ligesom RAPD, bruger en eller flere primere på 15-24 nukleotider lange. Men i dette tilfælde består primerne af tandem korte 2-4 nukleotid-gentagelser, for eksempel 5'- CA CA CA CA CA CA CA CA CA G og et eller to selektive nukleotider i 3'-enden af ​​primeren. ISSR-amplifikationsprodukterne indeholder en inverteret mikrosatellit-primersekvens på flankerne. Da primersekvensen i denne metode er specifik og mere strengt udvalgt end i RAPD, kan PCR-annealing udføres ved en højere temperatur (55-60°C) end for RAPD-metoden, og derfor er fingeraftrykket normalt bedre reproducerbart.
• AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism ) [10]  er en teknologi, der er en kombination af RFLP- og PCR-metoder .  AFLP er en kompleks metode, der består af flere trin: genomisk DNA er samtidigt begrænset af to restriktionsendonukleaser ( EcoRI og Msel ), der genkender henholdsvis 4 og 6 baser, hvilket resulterer i fragmenter med overhængende 3'-ender. Det begrænsede genomiske DNA ligeres derefter til en adapter indeholdende "klæbrige" ender for restriktionssteder ( EcoRI og Msel ). Derefter udføres to på hinanden følgende PCR'er. Den første PCR (præamplifikation) bruger primere, der er fuldt komplementære til EcoRI- og Msel-adapterne . Efter den første PCR dannes et stort antal amplifikationsprodukter mellem EcoRI- og Msel-adapterne , som er svære at differentiere ved hjælp af elektroforese. Derfor, i den anden PCR, indeholder primere med adaptere EcoRI og Msel ved 3'-enden yderligere og ikke-komplementære adaptere fra 1 til 3 baser til selektiv amplifikation. Adskillelsen af ​​DNA-fragmenter udføres i en polyacrylamidgel, med henholdsvis et radioaktivt eller fluorescerende mærke.
• SSAP ( Sequence Specific Amplification Polymorphism ) [11] var en  modifikation af AFLP- metoden til at detektere polymorfi både på restriktionsstedet og ved insertionen[ clear ] i det genomiske DNA af en transposon eller retrotransposon . Det genomiske DNA fra de undersøgte prøver spaltes med restriktionsenzymer PstI og Msel , og fragmenter med udragende 3'-ender opnås. Det begrænsede DNA ligeres derefter til PstI- og Msel-adaptorerne . Den første polymerasekædereaktion (præamplifikation) udføres med primere fra PstI- og Msel-adaptorer , det vil sige, at alle mulige kombinationer af disse adaptorer i det begrænsede genomiske DNA amplificeres. Efter den første PCR dannes et stort antal amplifikationsprodukter af DNA-fragmenter lokaliseret mellem primere og adaptere. PCR-produkterne fortyndes og anvendes til en anden, selektiv PCR. Den anden PCR udføres med den mærkede LTR -primer og enhver adapterprimer, enten med PstI eller Msel . Den anden PCR kan anvende primere til adapteren med yderligere nukleotider i 3'-enden, for eksempel et, to eller tre nukleotider, der ikke er komplementære til adapteren. Elektroforese efter den anden PCR udføres i en polyacrylamidgel eller i en sequencer, hvis der blev anvendt et fluorescerende mærke. Amplifikationsprodukter efter den anden PCR dannes som et resultat af amplifikation af DNA-fragmentet mellem LTR-sekvensen af ​​retrotransposonet og adapteren. At opnå amplifikationsprodukter mellem kun LTR-sekvenser er grundlæggende muligt, men som regel er afstanden mellem to retrotransposoner længere end størrelsen af ​​PCR-produkter, der normalt opnås (2500-3000 basepar). Og amplifikationsprodukter mellem adaptere vil ikke blive påvist, da kun mærket for LTR-primeren bruges.
• IRAP arkivkopi dateret 30. oktober  2016 på Wayback Machine  ( Inter Retrotransposone Amplified Polymorphism ) [12] [13]  er en polymerasekædereaktion mellem primere, der er komplementære til sekvenserne af to tilstødende retrotransposon LTR'er . Metoden har flere muligheder. Den første version af IRAP bruger en enkelt primer fra LTR. Amplifikationsprodukter dannes mellem to inverterede LTR'er med den samme sekvens, det vil sige, i en streng er 5'-enden af ​​en LTR orienteret mod 3'-enden af ​​den anden LTR. Hvis den centrale del af retrotransposonet er længere end den sædvanlige størrelse af PCR-produkter (ca. 3000 basepar), så vil PCR kun køre mellem to LTR'er fra forskellige retrotranspositioner. I dette tilfælde skal tilstødende LTR'er vendes om. En anden version af IRAP bruger to forskellige primere til inverterede LTR'er: en primer ved 5'-enden og den anden i 3'-enden af ​​LTR'en, orienteret væk fra retrotransposonen. I dette tilfælde er tilstødende LTR'er arrangeret som direkte lange gentagelser. Og endelig, i den tredje version af IRAP, anvendes LTR-primere fra forskellige retrotraposoner i forskellige orienteringer. Du kan kombinere primere fra LTR med andre primere fra gentagne DNA.
• REMAP ( Retrotransposone Microsatellite  Amplified Polymorphism ) [12] [13]  er en polymerasekædereaktion mellem en primer for LTR -fragmentet af en retrotransposon og en primer fra en nærliggende, simpel mikrosatellitgentagelse (ISSR-primer). I dette tilfælde er positionen af ​​det amplificerede retrotransposonfragment "forankret" ved anvendelse af en primer til mikrosatellit-locuset. For eksempel i planter er det bekvemt at anvende en LTR-primer og en mikrosatellitprimer (5' - CACACACACACACACACACAg ) med et enkelt selektivt nukleotid i 3'-enden af ​​primeren. REMAP bruger LTR-primervarianter til både 5'-enden og 3'-enden af ​​LTR, som i IRAP.
• RBIP ( Retrotransposon-Based  Insertion Polymorphisms ) [14]  er en metode baseret på brugen af ​​primere til retrotransposonsekvenser og afsløring af codominante allelvarianter. Dens princip er baseret på multilocus PCR, som bruger et par primere, der flankerer DNA-regionen før retrotransposition, og en primer til LTR af retrotransposonet, som indsættes i denne region mellem de første to primere. Som et resultat af PCR vil en af ​​varianterne af fragmenterne flankeret af et par primere blive amplificeret, da sekvensen mellem LTR'er er for lang til PCR mellem genomiske DNA-steder med en retrotransposon indeni. Denne metode detekterer kun polymorfi for et givet polymorf locus. Dens fordele omfatter codominansen af ​​polymorfe varianter, muligheden for at bruge et stort antal varianter til dot-blot-analyse.
• iPBS ( inter PBS amplification ) [15]  er en metode baseret på brugen af ​​primere til PBS (primer binding site ) retrotransposonsekvenser .  Metoden er effektiv til påvisning af polymorfi mellem prøver, såvel som til kloning af nye retrotransposoner i eukaryoter . 
• Enkelt nukleotidpolymorfi (SNP).

Noter

1. ↑ Southern EM Detektion af specifikke sekvenser blandt DNA-fragmenter adskilt ved gelelektroforese  // J  Mol Biol : journal. - 1974. - Bd. 98 , nr. 3 . - S. 503-517 . - doi : 10.1016/S0022-2836(75)80083-0 .
2. ↑ Jeffreys AJ, Wilson V., Thein SW Hypervariable 'minisatellit'-regioner i humant DNA   // Nature . - 1984. - Bd. 314 . - S. 67-73 . - doi : 10.1038/314067a0 .
3. ↑ Kalendar R. Brugen af ​​retrotransposon-baserede molekylære markører til at analysere genetisk diversitet  //  Mark- og grøntsagsforskning: tidsskrift. - 2011. - Bd. 48 , nr. 2 . - S. 261-274 . - doi : 10.5937/ratpov1102261K .
4. ↑ Kalendar R., Flavell A., Ellis THN, Sjakste T., Moisy C., Schulman AH Analyse af plantediversitet med retrotransposon-baserede molekylære markører  //  Heredity : journal. - 2011. - Bd. 106 . - S. 520-530 . - doi : 10.1038/hdy.2010.93 .
5. ↑ Kalender R.N., Glazko V.I. Typer af molekylærgenetiske markører og deres anvendelse  // Fysiologi og biokemi af dyrkede planter: tidsskrift. - 2002. - T. 34 , nr. 4 . - S. 141-156 .  (Russisk) (utilgængeligt link)
6. ↑ Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV DNA-polymorfier amplificeret af vilkårlige primere er nyttige som genetiske markører  //  Nucleic Acids Research : journal. - 1990. - Bd. 18 , nr. 22 . - P. 6531-6535 . doi : 10.1093 / nar/18.22.6531 .
7. ↑ Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomer ved hjælp af PCR med vilkårlige primere  //  Nucleic Acids Research : journal. - 1990. - Bd. 18 . - P. 7213-7218 . doi : 10.1093 / nar/18.24.7213 .
8. ↑ Sivolap Yu.M., Calendar R.N., Chebotar S.V. Genetisk polymorfi af kornplanter ved hjælp af PCR med vilkårlige primere  // Tsitol Genet. : journal. - 1994. - T. 28 . - S. 54-61 . (Russisk)
9. ↑ Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genomfingeraftryk ved simpel sekvensgentagelse (SSR ) -forankret polymerasekædereaktionsforstærkning   // Genomics  : journal. - Academic Press , 1994. - Vol. 20 , nej. 2 . - S. 176-183 . doi : 10.1006/ geno.1994.1151 .
10. ↑ Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., et al. AFLP: en ny teknik til DNA-fingeraftryk  //  Nucleic Acids Research : journal. - 1995. - Bd. 23 . - P. 4407-4414 . doi : 10.1093 / nar/23.21.4407 .
11. ↑ Waugh R., McLean K., Flavell AJ, Pearce SR, Kumar A., ​​​​Thomas BB, Powell W. Genetisk fordeling af Bare-1-lignende retrotransposable elementer i byggenomet afsløret af sekvensspecifikke amplifikationspolymorfismer (S -SAP )  (engelsk)  // Molecular General Genetics: tidsskrift. - 1997. - Bd. 253 , nr. 6 . - s. 687-694 . - doi : 10.1007/s004380050372 .
12. ↑ 1 2 Kalendar R., Grob T., Regina M., Suoniemi A., Schulman AH IRAP og REMAP: To nye retrotransposon-baserede DNA-fingeraftryksteknikker   // Theoretical and Applied Genetics : journal. - 1999. - Bd. 98 . - S. 704-711 . - doi : 10.1007/s001220051124 .
13. ↑ 1 2 Kalendar R., Schulman AH IRAP og REMAP til retrotransposon-baseret genotyping og fingeraftryk   // Nature Protocols : journal. - 2006. - Bd. 1 , nr. 5 . - P. 2478-2484 . - doi : 10.1038/nprot.2006.377 .
14. ↑ Flavell AJ, Knox MR, Pearce SR, Ellis THN. Retrotransposon-baserede insertionspolymorfismer (RBIP) til high throughput markøranalyse  //  The Plant Journal : journal. - 1998. - Bd. 16 , nr. 5 . - S. 643-650 . - doi : 10.1046/j.1365-313x.1998.00334.x .
15. ↑ Kalendar R., Antonius K., Smykal P., Schulman AH  iPBS : En universel metode til DNA-fingeraftryk og retrotransposonisolering  // Teoretisk og anvendt genetik : journal. - 2010. - Bd. 121 , nr. 8 . - S. 1419-1430 . - doi : 10.1007/s00122-010-1398-2 .