Ligationsfri kloning ( LIC , Ligation Independent Cloning ), i genteknologi , er en metode til opnåelse af plasmider, der ikke anvender restriktions- og ligeringsreaktioner.
Teknologien med ligasefri kloning reducerer tiden til at skabe nye genetiske konstruktioner, for eksempel til ekspression af et rekombinant protein , og er bedst egnet til en høj-throughput proteinproduktionslinje. For ligeringsfri kloning er det nødvendigt at fremstille en LIC-vektor - en lineariseret DNA-sekvens med specifikke klæbrige ender 11-14 nukleotider lange . For at gøre dette hydrolyseres vektormolekylet med et restriktionsenzym på ét sted og behandles derefter med T4-fag-DNA-polymerase i nærværelse af et af nukleotiderne. 3'-exonukleaseaktiviteten af dette enzym fører til fjernelse af nukleotider fra 3'-enden, indtil nukleotidet til stede i reaktionsblandingen findes i sekvensen (se figur). Vektormolekylet er specielt fremstillet på en sådan måde, at dette nukleotid ikke forekommer på begge sider af restriktionsstedet for 11-14 enheder. Når en LIC-vektor er blevet isoleret, kan den opbevares og genbruges til at klone målproteingener ind i den. Primere til PCR af disse gener er valgt således, at de på den ene side er komplementære til begyndelsen eller slutningen af målgenet, og på den anden side til de klæbrige områder af LIC-vektoren. Derefter opnås efter PCR et proteingen, hvor der på begge sider er enkeltstrengede sekvenser på 11-14 nukleotider lange, komplementære til vektoren. Det er nok at blande et sådant produkt med en vektor og transformere kompetente bakterieceller med blandingen for at opnå plasmider med proteingenet. Ligeringsfri kloning undgår således adskillige trin med restriktion, gelering og ligering, som alle kan forårsage kloningsfejl.
1. De Jong, R. Enzyme Free Cloning for high throughput gen kloning og ekspression / R. de Jong, M. Daniels, R. Kaptein og G. Folkers // J. Struct. Funktion. Genomik. - 2006. - V. 7. - S. 109–118.
2. Lee, J. High-throughput T7 LIC vektor til introduktion af C-terminal poly-histidin tags med variable længder uden ekstra sekvenser / J. Lee og S. Kim // Prot. Udtr. Purif. - 2009. - V. 63. - S. 58–61.
3. Novy, R. Ligeringsuafhængig kloning: Effektiv retningsbestemt kloning af PCR-produkter / R. Novy, K. Yaeger og K. Kolb // Innovations. - 1997. - V. 5. - S. 1-3.
4. Bardóczy, V. Et sæt af ligeringsuafhængige in vitro translationsvektorer til eukaryotisk proteinproduktion / V. Bardóczy, V. Géczi, T. Sawasaki, Y. Endo og T. Mészáros // BMC Biotechnology. - 2008. - V. 8. - Nr. 32. - S. 1-7.