Fluorescens nanoskopi

Fluorescens nanoskopi er en metode  til at detektere fluorescerende objekter ved hjælp af et optisk mikroskop , som har en rumlig opløsning flere gange højere end den teoretiske grænse for optisk diffraktion (~200 nm).

Beskrivelse

I de senere år er der udviklet flere nye tilgange inden for fluorescensmikroskopi, som har gjort det muligt at overvinde diffraktionsbarrieren for optisk opløsning og opnå en hidtil uset opløsning på ~10 nm. Disse metoder begyndte at blive forenet under den generelle betegnelse fluorescens nanoskopi.

Fluorescerende nanoskopisystemer er baseret på tre fundamentalt forskellige tilgange:

• forbedring af fokusering på grund af skabelsen af ​​nye optiske skemaer og brugen af ​​linser med en høj vinkelblænde ( 4Pi- , I5M- og I5S-mikroskopi);
• brug af fænomenet total intern refleksion (total intern refleksion fluorescensmikroskopi, TIRFM);
• kontrolleret "on" og "off" af fluorescerende molekyler og deres sekventielle detektion ( STED , GSD, SPEM ( SSIM ), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT).

Flere anvendelser af fluorescerende nanoskopiske teknikker i biologi og medicin kan forestilles. Nanoskopi giver dig mulighed for direkte at studere interaktionerne mellem proteiner , DNA og RNA , og kan derfor spille en væsentlig rolle i udviklingen af ​​genomik og proteomik , i studiet af cellefysiologi, for at forstå de patofysiologiske mekanismer forbundet med nedsat dannelse af kompleks proteinkomplekser osv. [1]

Disse tilgange diskuteres mere detaljeret nedenfor:

• 4Pi og I5M er implementeret på basis af et to-objektiv system, som forbedrer opløsningen langs den optiske akse op til 80 nm på grund af summeringen af ​​to modsatte sfæriske lysfronter i brændpunktet. I5S har forbedret opløsning i brændplanet (op til 100 nm).
• TIRFM gør det muligt at detektere fluorescerende objekter i et ~100 nm tykt grænselag med en opløsning på op til 10 nm.
• STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, MALING. Absorptionen af ​​et lyskvante af et molekyle ledsages af overgangen af ​​en elektron fra jordenerginiveauet (S0 ) til et exciteret fluorescerende niveau (singlet S 1 eller triplet T 1 ). Absorption kan også inducere reversible intramolekylære omlejringer (for eksempel cis-trans- isomerisering ), hvilket resulterer i en ændring i fluorescensspektret . Enhver af overgangene S 0 → S 1 , S 0 → T 1 kan bruges til at tænde/slukke fluoroforer og øge opløsningen.

Stimuleret emissionsdepletering (STED) mikroskopi er således baseret på samtidig brug af to lysstråler - en fokuseret stråle, der exciterer en fluorofor i den centrale zone (S 0 → S 1 ), og en stråle, der har formen bagel og slukker fluoroforer omkring den centrale zone (S 1 → S 0 ). Fluorescens registreres således kun fra donuthullet. Opløsningen af ​​metoden er bestemt af loven, hvor I s er den strålingseffekt, der kræves for at sikre den præferenceovergang S 1 → S 0 ; I max er slukningsstrålingseffekten. Opløsningen viser sig således at være justerbar (afhængig af kildens effekt) og teoretisk uendelig (ved I max /I s → ∞). I praksis er en tærskel på ~10 nm nået, hvilket svarer til dimensionen af ​​biologiske makromolekyler .

Mættet struktureret belysningsmikroskopi (SSIM) eller saturated pattern excitation microscopy (SPEM) er bygget på et lignende princip . Ground state depletion (GSD) mikroskopi implementerer et lignende princip, men slukker den exciterede tilstand ved at overføre molekylet til en længerevarende T 1 tilstand. Endelig er reversibel, mættet optisk fluorescerende overgangsmikroskopi (RESOLFT ), fotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (PALM) og stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM ) baseret på at tænde/slukke for fluoroforer på grund af deres fotokemiske isomerisering .

Analyse af placeringen af ​​fluoroforer i 3D-rum udføres af disse metoder på forskellige måder. STED, GSD, SPEM/SSIM og RESOLFT bruger optisk fokusering til sekventielt at registrere et signal fra givne rumlige koordinater; PALM og STORM slukker fluoroforer tilfældigt og akkumulerer samtidig signaler fra tændte fluoroforer placeret i en afstand af .

Noter

1. ↑ Peters R. Fra fluorescens nanoskopi til nanoskopisk medicin // Nanomedicin. V. 3, 2008. S. 1-4.

Litteratur

• Hell SW Far-Field Optical Nanoscopy // Videnskab. 2007. V. 316. S. 1153–1158.

Links