Kvantitativ analyse af nukleinsyrer - bestemmelse af koncentrationen af DNA eller RNA i en blanding eller rent præparat. Reaktioner, der involverer nukleinsyrer, kræver ofte nøjagtig information om mængden og renheden af lægemidlet. For at bestemme koncentrationen af nukleinsyre i opløsning, anvendes en spektrofotometrisk metode og UV-fluorescens, hvis nukleinsyren indeholder et farvestof.
Nukleinsyrer absorberer ultraviolet lys på en bestemt måde . I spektrofotometre udsættes prøven for ultraviolet lys ved en bølgelængde på 260 nm, og en fotodetektor måler mængden af lys, der er passeret gennem prøven. Jo mere lys der absorberes, jo højere er koncentrationen af nukleinsyre i prøven.
Ved hjælp af Bouguer-Lambert-Beer-loven er det muligt at korrelere koncentrationen af molekyler, der absorberer stråling, med mængden af absorberet lys. Ved en bølgelængde på 260 nm er den gennemsnitlige ekstinktionskoefficient for dobbeltstrenget DNA 0,020 (μg/mL) −1 cm −1 , for enkeltstrenget DNA 0,027 (μg/mL) −1 cm −1 , for enkeltstrenget RNA 0,025 (μg/mL) −1 cm −1 og for korte enkeltstrengede oligonukleotider afhænger ekstinktionskoefficienten af længden og forholdet mellem nitrogenholdige baser (ca. 0,030 (μg/mL) −1 cm −1 ). Derfor svarer den optiske densitet ( eng. OD, optisk densitet ) lig med 1 til en koncentration af dobbeltstrenget DNA på ca. 50 µg/ml. Den spektrofotometriske metode til bestemmelse af koncentrationen af nukleinsyrer anvendes ved koncentrationer op til 2 OD. [1] Mere nøjagtige ekstinktionskoefficienter er nødvendige for at bestemme koncentrationen af oligonukleotider og kan forudsiges ved hjælp af den nærmeste nabomodel. [2]
| Nukleinsyretype | Koncentration (µg/ml) for 1 enhed A 260 |
|---|---|
| dsDNA (dobbeltstrenget DNA) | halvtreds |
| ssDNA (enkeltstrenget DNA) | 37 |
| ssRNA (enkeltstrenget RNA) | 40 |
For at bestemme prøvekoncentrationen skal den optiske tæthed fundet i en standardkuvette med en optisk vej på 10 mm multipliceres med den passende koefficient. For eksempel svarer en absorbansværdi på 0,9 optiske enheder af dobbeltstrenget DNA til en koncentration på 45 μg/ml.
Mange biologiske undersøgelser ( DNA-mikroarray , kvantitativ PCR ) kræver kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af små volumener af nukleinsyrer. Specielle nanofotometre [3] gør det muligt at bestemme koncentrationen af prøver uden hjælp af en kuvette i submikrolitervolumener, startende fra 0,3 μl. Da målinger foretages på en ufortyndet prøve, er reproducerbarheden af resultaterne meget høj, og selve prøverne kan bruges efter analyse.
Nukleinsyreprøver indeholder ofte urenheder af proteiner og andre organiske stoffer. Absorbansforholdet ved 260 og 280 nm (A 260/280 ) bruges ofte til at vurdere renheden af et præparat. Rent DNA har et A 260/ 280 -forhold på omkring 1,8, en RNA-prøve uden urenheder A 260/280 omkring 2.
Proteinurenheder og forholdet 260:280For at påvise proteinurenheder i opløsninger af nukleinsyrer analyseres absorptionsforholdet af opløsninger ved bølgelængder på 260 og 280 nm, da aromatiske aminosyrer i proteiner absorberes ved 280 nm [1] [4] . Imidlertid er indflydelsen af urenhedsproteiner på bestemmelsen af koncentrationen af nukleinsyrer lille - kun ved en signifikant proteinkoncentration forskydes forholdet 260:280 signifikant [1] [5] .
Forholdet 260:280 gør det muligt at bestemme blandingen af nukleinsyrer i proteinopløsninger og blandingen af proteiner i opløsninger af nukleinsyrer:
| % egern | % nukleinsyre | forhold 260:280 |
|---|---|---|
| 100 | 0 | 0,57 |
| 95 | 5 | 1.06 |
| 90 | ti | 1,32 |
| 70 | tredive | 1,73 |
Forholdet 260:230 er mindre følsomt ved bestemmelse af proteinurenheder i en nukleinsyreopløsning:
| % nukleinsyre | % egern | forhold 260:230 |
|---|---|---|
| 100 | 0 | 2.00 |
| 95 | 5 | 1,99 |
| 90 | ti | 1,98 |
| 70 | tredive | 1,94 |
Sådanne forskelle skyldes den højere værdi af den molære ekstinktionskoefficient for nukleinsyrer ved bølgelængder på 260 og 280 nm i sammenligning med proteiner. Derfor, selv for en proteinopløsning med en relativt høj koncentration, er bidraget til absorption ved bølgelængder på 260 og 280 nm lille. Proteinkontamination i nukleinsyreopløsning kan ikke bestemmes ved forholdet 260:230.
Anden forureningTil diagnostiske formål er det ofte nødvendigt at bestemme mængden af et bestemt DNA eller RNA. Der er udviklet meget følsomme metoder til bestemmelse af DNA og RNA i mikrovolumener af prøver - dråber, der ikke overstiger nogle få picoliter. Til dette anvendes mikrofluidiske enheder til PCR med en enkelt kopi af nukleinsyren [7] [8] [9] [10] .