Immunpræcipitation er en metode til at isolere et protein fra komplekse blandinger såsom cellelysater , sera og vævshomogenater ved hjælp af proteinspecifikke antistoffer . Immunpræcipitation gør det muligt at detektere ændringer i proteinekspression , at karakterisere proteiner, som det undersøgte protein danner et kompleks med, at identificere proteinbindingssteder med nukleinsyrer [1] .
Ved udførelse af immunpræcipitation binder antistoffer sig til mikroperler. De mest almindeligt anvendte mikroperler er lavet af agarose . Mikroperler med magnetiske egenskaber kan også anvendes. Ved hjælp af en magnet kan magnetiske mikroperler, der bærer antigen-antistof- , opbevares i reagensglasset, mens prøvekomponenterne, der ikke er bundet til antistoffet, fjernes fra det [1] .
Afhængigt af metoden til antistofbinding på mikroperler er der tre immunpræcipitationsteknologier. Den klassiske teknologi bruger mikroperler belagt med protein A eller protein G. Protein A, ligesom protein G, kan binde til Fc -regionen af en lang række antistoffer. Et antistof specifikt for det protein, der skal isoleres, inkuberes med blandingen, hvorfra proteinet skal isoleres. Efter at komplekset af det udskilte protein ( antigen ) med antistoffet er dannet, indføres i blandingen mikroperler belagt med protein A eller protein G. Antigen-antistof komplekserne binder på mikroperlerne. Ved hjælp af centrifugering og vask adskilles mikroperler med tilhørende antigen-antistofkomplekser fra blandingen. Antigen og antistof elueres fra mikroperlerne. Nogle gange tilsættes mikroperler til blandingen, som antistofferne tidligere har været bundet til. Den største ulempe ved den klassiske teknologi er, at elueringen af det isolerede protein fra mikropartiklen også vil fjerne antistoffet fra mikropartiklen. Som følge heraf vil det isolerede protein blive forurenet, og antistofferne kan ikke genbruges [1] .
Kontaminering af det isolerede protein og tab af antistoffer kan undgås ved at immobilisere antistofferne på mikropartiklen. Der er to teknologier: immobilisering på grund af kovalent tværbinding af antistoffet og protein A eller protein G placeret på overfladen af mikropartiklen, og immobilisering på grund af dannelsen af en kovalent binding mellem antistoffet og mikropartiklens materiale. Disse teknologier har også deres ulemper. En ulempe ved kovalent at binde et antistof til protein A eller protein G er, at tværbindingsreagenset kan danne kovalente bindinger på arbitrære steder på antistoffet, hvilket beskadiger det aktive sted , og som et resultat mister antistoffet sin evne til at binde antigenet. Ulempen ved kovalent at forbinde antistoffet og mikropartikelmaterialet er, at i modsætning til protein A eller protein G teknologier vil en vilkårlig region af antistoffet binde til mikropartiklen, hvilket kan føre til tab af antistoffets evne til at binde antigenet. [1] .
I en situation, hvor antistoffer mod et isoleret protein ikke er tilgængelige, kan et tag syes til det ved hjælp af genteknologiske metoder (for eksempel et FLAG-tag ), som antistoffer er tilgængelige mod [2] .
Fordelene ved immunpræcipitation omfatter det faktum, at antigener i denne metode interagerer med antistoffer i deres native konformation for yderligere adskillelse og kvantitativ analyse. Desuden giver metoden til immunpræcipitation dig mulighed for at koncentrere proteinet. Ulempen ved metoden er, at for effektiv påvisning skal proteinet være radioaktivt mærket [3] .
Co-immunpræcipitation (Co-IP) er immunfældning af et helt proteinkompleks , som er baseret på brugen af et antistof specifikt for et af de proteiner, der udgør komplekset. Ved at binde dette protein binder antistoffet hele komplekset. Som et resultat bliver det muligt at identificere alle de proteiner, der udgør komplekset [1] .
Chromatin immunopræcipitation (ChIP) er en metode til at finde bindingssteder for det undersøgte DNA-bindende protein i genomet . For at gøre detteisoleres DNA fra cellen og skæres i små fragmenter, og derefter udføres immunpræcipitation ved hjælp af antistoffer mod det undersøgte DNA-bindende protein. Som et resultat binder komplekser bestående af det undersøgte DNA-bindende protein og et DNA -fragment til antistoffer . Sådanne DNA-fragmenter er bindingsstederne for det undersøgte DNA-bindende protein i genomet. For at aflæse nukleotidsekvensen af disse DNA-fragmenter anvendes DNA-mikroarrays (ChIP-on-chip) eller moderne sekventeringsmetoder (ChIP-seq) [4] [5] .
RNA- immunpræcipitation (RIP) er en metode, der giver dig mulighed for at identificere RNA-molekyler, der interagerer med det RNA-bindende protein, der undersøges, og bestemme bindingsstederne for det undersøgte protein med RNA-molekyler. Proceduren for RNA-immunfældning ligner kromatin -immunfældning . For at aflæse nukleotidsekvensen af de isolerede RNA-fragmenter anvendes DNA-mikroarrays, der tidligere har opnået DNA-molekyler komplementære til de udvalgte fragmenter (RIP-chip), eller moderne sekventeringsmetoder (RIP-seq) [6] .