Knockout mus

En knockout-mus  er en genetisk modificeret laboratoriemus, hvor et af generne bevidst slås ud ved deletion eller udskiftning med en bestemt nukleotidsekvens . Med deres hjælp er det let at studere rollerne af sekventerede gener, hvis funktioner endnu ikke er blevet bestemt. Ved at forstyrre et bestemt gen og undersøge de resulterende forskelle fra normal adfærd eller fysiologi, kan forsøgsledere forsøge at bestemme dets funktion.

Menneskets fysiologi ligner musens, og videnskabsmænd kan bruge disse dyr til at teste medicinske teknologier relateret til menneskelig fysiologi, da brugen af ​​menneskelige embryoner ikke accepteres af det videnskabelige samfund af etiske årsager. Derfor er mus i øjeblikket den bedst egnede forsøgsdyreart, som knockout-metoden let kan anvendes til. Den første knockout-mus blev skabt af Mario R. Capecchi , Martin Evans og Oliver Smithies i 1989, for hvilken de blev tildelt Nobelprisen i fysiologi eller medicin2007. Aspekter af knockout-museteknologien og selve musene er blevet patenteret i mange lande af private virksomheder. Gen-knockout hos laboratorierotter er meget vanskeligere og er først blevet muligt siden 2003 [1] [2] .

Brug

At slukke for aktiviteten af ​​et gen giver værdifulde ledetråde til, hvordan det virker. På grund af ligheden mellem menneskelige og musegener giver observation af karakteristika for knockout-mus data til forskere. Ved hjælp af informationen drager forskerne konklusioner om et gens rolle i udviklingen af ​​en organisme [3] , især om evnen til at reagere på sygdomme hos mennesker.

Eksempler på forskning, hvor knockout-mus har været nyttige, omfatter studier og modellering af forskellige typer kræft, fedme, hjertesygdomme, diabetes, gigt, stofmisbrug, angst, aldring og Parkinsons sygdom . Knockout-mus tilbyder også en biologisk kontekst, hvor lægemidler og andre terapier kan udvikles og testes.

Fremgangsmåde

"For at opnå knockout-mus introduceres den resulterende gensplejsede konstruktion i embryonale stamceller, hvor konstruktionen gennemgår somatisk rekombination og erstatter det normale gen, og de modificerede celler implanteres i forædlingen af ​​nye sorter ved klassisk selektion er næsten umuligt, derfor På nuværende tidspunkt er de største håb sat til genteknologi. Gen-knockout kan bruges til at studere funktionen af ​​et bestemt gen. Dette er navnet på teknikken til at slette et eller flere gener, som gør det muligt at studere konsekvenserne af en sådan mutation. Til knockout syntetiseres det samme gen eller dets surrogatmors blastocyst" [4] .

Avlsplan for at få knockout-mus. Skabelsen af ​​mus begynder i det øjeblik, hvor cellekulturer skabes, hvorved den ønskede organisme bliver skabt i et ungt embryo. Ved anvendelse af lambda-fag eller cosmid ekstraheres målgenet fra musens genomiske bibliotek ved in vivo-metoden. En dominant selekterbar markør indsættes i stedet, mens målgenet deleteres på samme tid . "Som et resultat opnås et (molekylærbiologi) | hybridplasmid , hvor segmenter af målmusegenet (flankerende sekvenser) er knyttet til den selekterbare markør til højre og venstre. Celler med et inaktiveret gen indsættes i blastocytter. Embryonale stamceller isoleres fra museblastocysten (meget ungt embryo) og dyrkes in vitro. I dette eksempel vil vi tage hvide musestamceller. Blastocyster indeholdende celler, der både er vilde og knockout-celler, sprøjtes ind i adoptivmoderens livmoder .Dette resulterer i afkom eller vildtype, farvet i samme farve som en blastocystdonor (grå) eller en kimær (blandet) og delvist slået ud Chimera mus krydses med en normal vildtype (grå) mus, der producerer afkom, der er enten hvide og heterozygote for det knockout-gen, eller grå og vildtype. Hvide heterozygote mus kan efterfølgende avles til at producere mus, der er homozygote for gen-knockouten.

Der er flere variationer i proceduren for at opnå knockout-mus; nedenfor er et typisk eksempel.

Den nye sekvens fra trin 1 indføres i stamcellerne fra trin 2 ved elektroporation. Som et resultat af den naturlige proces med homolog rekombination vil nogle af de elektroporerede stamceller inkorporere den nye knockout-gensekvens i deres kromosomer i stedet for det originale gen. Chancerne for en vellykket rekombinationshændelse er relativt lave, så de fleste ændrede celler vil kun have den nye sekvens på et af de to tilsvarende kromosomer - de betragtes som heterozygote. Celler, der er blevet transformeret med en vektor indeholdende et neomycinresistensgen og et herpes tk+ gen, dyrkes i en opløsning indeholdende neomycin og ganciclovir for at selektere for transformationer, der er sket gennem homolog rekombination. Enhver DNA-indsættelse, der sker som følge af en utilsigtet indsættelse, vil dø, fordi de tester positive for både neomycinresistensgenet og tk+ herpesgenproduktet, hvis genprodukt reagerer med ganciclovir og danner et dødeligt toksin. Desuden tester celler, der ikke integrerer nogen af ​​de genetiske materialer, negativ for begge gener og dør derfor som følge af neomycinforgiftning.

Embryonale stamceller, der inkluderede knockout-genet, isoleres fra uændrede celler ved hjælp af markørgenet fra trin 1. For eksempel kan uændrede celler dræbes med et toksisk middel, som de ændrede celler er resistente over for. Knockout embryonale stamceller fra trin 4 injiceres i en museblastocyst. Til dette eksempel bruger vi grå museblastocyster. Blastocyster indeholder nu to typer stamceller: originale (fra en grå mus) og knockout-celler (fra en hvid mus). Disse blastocyster implanteres derefter i livmoderen på hunmus, hvor de udvikler sig. Således vil nyfødte mus være kimærer: nogle dele af deres kroppe er dannet af de oprindelige stamceller, andre fra udslåede stamceller. Deres pels vil vise hvide og grå pletter, med hvide pletter afledt af udslåede stamceller og grå pletter fra modtagerblastocysten. Nogle nyfødte kimære mus vil have gonader afledt af udslettede stamceller og vil derfor producere æg eller sæd, der indeholder det udslettede gen. Når disse kimære mus krydses med andre vildtype mus, vil nogle af deres afkom have én kopi af knockout-genet i alle deres celler. Disse mus bevarer ikke noget gråt muse-DNA og er ikke kimærer, men de er stadig heterozygote. Når disse heterozygote afkom krydser hinanden, vil nogle af deres afkom arve knockout-genet fra begge forældre; de bærer ikke en funktionel kopi af det oprindelige uændrede gen (det vil sige, at de er homozygote for denne allel). En detaljeret forklaring på, hvordan knockout-mus (KO) skabes, findes på 2007 Nobelprisen i fysiologi eller medicin hjemmeside [5] .

Begrænsninger

National Institutes of Health diskuterer nogle vigtige begrænsninger ved denne teknik [6] .

Som alle laboratoriemus har knockout-mus ikke god immunitet over for naturlige sygdomme. Men dette opvejes af deres høje følsomhed over for det specifikke patogen, som de er skabt til.

Selvom knockout-museteknologi er et værdifuldt forskningsværktøj, er der nogle vigtige begrænsninger. Omkring 15 procent af gen-knockouts er udviklingsmæssigt dødelige, hvilket betyder, at de genetisk modificerede embryoner ikke kan vokse til voksne mus. Dette problem overvindes ofte med betingede mutationer. Manglen på voksne mus begrænser forskningen til embryonal udvikling og gør det ofte vanskeligt at bestemme genets funktion i forhold til menneskers sundhed. I nogle tilfælde kan et gen udføre en anden funktion hos voksne, end det gør ved at udvikle embryoner.

At slå et gen ud kan heller ikke resultere i mærkbare ændringer i musen, eller kan endda resultere i egenskaber, der er forskellige fra dem, der ses hos mennesker, der har det samme gen inaktiveret. For eksempel er mutationer i p53-genet forbundet med mere end halvdelen af ​​humane kræftformer og fører ofte til tumorer i et specifikt sæt væv. Men når p53-genet slås ud i mus, udvikler dyrene tumorer i et andet vævsarray.

Der er variabilitet gennem hele proceduren, i høj grad afhængig af stammen, hvorfra stamcellerne blev opnået. Typisk anvendes celler afledt af stamme 129. Denne specifikke stamme er ikke egnet til mange eksperimenter (f.eks. adfærdsmæssige), så det er meget almindeligt at krydse afkom tilbage med andre stammer. Nogle genomiske loci har vist sig at være meget vanskelige at identificere. Årsager kan være tilstedeværelsen af ​​gentagne sekvenser, omfattende DNA-methylering eller heterochromatin. Den forvirrende tilstedeværelse af tilstødende 129 gener i et knockout-segment af det genetiske materiale er blevet betegnet som den "flankerende geneffekt". [7] Metoder og retningslinjer er blevet foreslået til at håndtere dette problem [7] .

En anden begrænsning er, at normale (dvs. ubetingede) knockout-mus udvikler sig i fravær af genet, der undersøges. Nogle gange kan tab af aktivitet under udvikling maskere rollen som et gen i voksenalderen, især hvis genet er involveret i flere processer, der spænder over udvikling. Derefter kræves betingede/inducerbare mutationstilgange, der først tillader musen at udvikle sig og modnes normalt, indtil genet af interesse er fjernet.

En anden stor begrænsning er manglen på evolutionære tilpasninger i knockout-modellen, der kan forekomme i vildtypedyr efter deres naturlige mutation. For eksempel er erytrocytspecifik co-ekspression af GLUT1 med stomatin en kompenserende mekanisme hos pattedyr, der ikke er i stand til at syntetisere C-vitamin [8] .

Noter

  1. ↑ Helen R. Pilcher. Det er en knockout   // Nature . - 2003. - doi : 10.1038/news030512-17 .
  2. ↑ Zan Y, Haag JD, Chen KS, Shepel LA, Wigington D, Wang YR, Hu R, Lopez-Guajardo CC, Brose HL, Porter KI, Leonard RA, Hitt AA, Schommer SL, Elegbede AF, Gould MN. Produktion af knockout-rotter ved hjælp af ENU-mutagenese og et gærbaseret screeningsassay  //  Nature Biotechnology. - 2003. - Bd. 21 , udg. 6 . — S. 645–51 . - doi : 10.1038/nbt830 . — PMID 12754522 .
  3. ↑ Shchelkunov S. N. Genteknologi . - Siberian University Publishing House, 2004. - S. 453.
  4. ↑ Rizvanova A. Kh. Bioetiske principper og genteknologi . - 2013. - S. 2.
  5. ↑ Nobelprisen i  medicin 2007 . nobelprize.org . Hentet 21. januar 2022. Arkiveret fra originalen 25. juni 2018.
  6. ↑ Knockout Mus Fact Sheet Arkiveret 16. december 2018 på Wayback Machine / National Human Genome Research Institute
  7. ↑ 1 2 Robert Gerlai. Gen-målrettede undersøgelser af pattedyrs adfærd: er det mutationen eller baggrundsgenotypen?  (engelsk)  // Trends in Neurosciences. - 1996. - Maj (bd. 19). - S. 177-181 . — ISSN 0166-2236 . - doi : 10.1016/S0166-2236(96)20020-7 .
  8. ↑ Crusio WE, Goldowitz D., Holmes A., Wolfer D. Standarder for publicering af musemutantundersøgelser  //  Gener, Brain and Behavior. - 2009. - 28. januar (bd. 8). - S. 1-4 . — ISSN 1601-1848 . - doi : 10.1111/j.1601-183X.2008.00438.x .
  Gå til Wikidata-elementet  Ordbøger og encyklopædier